εταιρικά νέα για mBio | Χρήση γονιδιωματικής τεχνολογίας για την αξιολόγηση της αντοχής στα αντιμικροβιακά του Escherichia coli σε χοίρους στην Ανατολική Κίνα για 12 χρόνια

Η τρέχουσα υπερβολική χρήση αντιβιοτικών στην ιατρική και τη γεωργία έχει οδηγήσει στην εμφάνιση αντιμικροβιακής αντοχής, μια σοβαρή απειλή για τη δημόσια υγεία. Ωστόσο, η τρέχουσα έρευνα έχει επικεντρωθεί σε μεγάλο βαθμό σε κλινικά περιβάλλοντα, με ανεπαρκή έρευνα που εξετάζει τα χαρακτηριστικά αντοχής του Escherichia coli από άρρωστα ζώα, ιδίως τον κίνδυνο μετάδοσης από ζώα σε ανθρώπους.

Πρόσφατα, μια ερευνητική ομάδα από το Ινστιτούτο Ζωοτεχνίας και Κτηνιατρικής της Ακαδημίας Γεωργικών Επιστημών Zhejiang και τη Σχολή Επιστημών Ζωής του Πανεπιστημίου Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας δημοσίευσε μια νέα μελέτη στο περιοδικό mBio. Χρησιμοποιώντας γονιδιωματική τεχνολογία, αυτή η μελέτη ανέλυσε την αντοχή στα αντιβιοτικά 114 στελεχών του Escherichia coli από άρρωστα γουρούνια που συλλέχθηκαν σε μια περίοδο 12 ετών στην ανατολική Κίνα. Η μελέτη εντόπισε, για πρώτη φορά, στελέχη εντεροτοξικού E. coli (ETEC) που φέρουν και τα δύο γονίδια mcr-1 και mcr-3.

Εισαγωγή

Η ακατάλληλη χρήση αντιβιοτικών στην κτηνοτροφία και την υγειονομική περίθαλψη έχει οδηγήσει στην ευρεία εξάπλωση βακτηρίων ανθεκτικών στα φάρμακα που φέρουν «γονίδια υπεραντίστασης» (όπως blaNDM, mcr-1 και tet(X4)). Αυτό έχει αποδυναμώσει την αποτελεσματικότητα των «αντιβιοτικών έσχατης ανάγκης» και έχει ως αποτέλεσμα την έλλειψη νέων φαρμάκων, δημιουργώντας ένα σοβαρό πρόβλημα.

Το E. coli, ως σημαντικό ζωονοσογόνο παθογόνο, μπορεί τόσο να προκαλέσει ασθένεια όσο και να διαδώσει γονίδια ανθεκτικά στα φάρμακα σε όλο το οικοσύστημα (όπως αυτά που φέρουν τα γονίδια υψηλού κινδύνου blaNDM-5, mcr-1 και tet(X4/X5)). Οι συνδυασμένες επιπτώσεις της υψηλής του λοιμογόνου δράσης και της πολυφαρμακευτικής αντοχής επιδεινώνουν τον κίνδυνο. Η αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος (WGS) είναι μια βασική τεχνολογία για την αναγνώριση γονιδίων αντοχής στα φάρμακα και παθογένειας, παρέχοντας τη βάση για την πρόληψη και τον έλεγχο των ασθενειών των ζώων και των ανθρώπων.

Αποτελέσματα Έρευνας

1. Επικράτηση του Escherichia coli σε αυτή τη μελέτη

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, αυτή η μελέτη ανέλυσε 114 απομονώσεις E. coli από άρρωστα και νεκρά γουρούνια από 82 εκτροφεία σε 11 πόλεις στην επαρχία Zhejiang μεταξύ 2010 και 2021. Αυτά τα γουρούνια υπέφεραν από διάρροια, σπληνομεγαλία και ηπατομεγαλία.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, η γονιδιωματική ανάλυση αποκάλυψε 39 τύπους αλληλουχίας (STs), εκ των οποίων ο ST88 (που αντιπροσωπεύει το 15,8%) ήταν ο πιο συνηθισμένος. Η υψηλότερη ποικιλομορφία ST παρατηρήθηκε στο Shaoxing και στο Hangzhou. Πολλαπλά ST συνυπήρχαν σε όλα τα έτη και τις πόλεις. Ορισμένοι τύποι ST (όπως ο ST88) ήταν σταθερά διαδεδομένοι κατά τη διάρκεια της εννεαετούς περιόδου, ενώ άλλοι (όπως ο ST117 και ο ST48) εμφανίστηκαν μόνο κατά τη διάρκεια συγκεκριμένων περιόδων. Η ταυτοποίηση των δειγμάτων ήταν αξιόπιστη και μικρές διαφορές SNP μεταξύ των στελεχών υποδήλωναν πιθανή διασταυρούμενη μετάδοση μεταξύ εκτροφείων και μεταβολή με την πάροδο του χρόνου.

Σχήμα 1. Επιδημιολογικά χαρακτηριστικά 114 απομονώσεων Escherichia coli

Σχήμα Α: Κατανομή δειγματοληψίας και χρόνος στην επαρχία Zhejiang (μπλε δείκτες)

Σχήμα Β: Συσχέτιση των στελεχών με την πόλη, το έτος και τα γονίδια αντοχής στα φάρμακα υψηλού κινδύνου. Το πάχος της γραμμής αντιστοιχεί στον αριθμό των στελεχών.

Σχήμα Γ: Ελάχιστο δέντρο που κατασκευάστηκε με βάση το MLST. Το μέγεθος του κόμβου αντιπροσωπεύει τον αριθμό των στελεχών και το μήκος του κλάδου αντικατοπτρίζει τη γενετική παραλλαγή.

Συμπέρασμα: Οι απομονώσεις E. coli από μολυσμένα γουρούνια στο Zhejiang παρουσίασαν υψηλή γενετική ποικιλομορφία (39 τύποι ST). Ωστόσο, οι λεπτές γενετικές διαφορές μεταξύ των στελεχών υποδηλώνουν επίσης τον κίνδυνο διασταυρούμενης μετάδοσης μεταξύ εκτροφείων. Το στέλεχος ST88 επέδειξε διαρκή επιδημική δραστηριότητα για έως και εννέα χρόνια.

Σχήμα 2. ANI 114 απομονώσεων E. coli

Τα ονόματα των στελεχών E. coli που απομονώθηκαν από το 2010 έως το 2017 σημειώνονται με μπλε χρώμα και τα ονόματα των στελεχών E. coli που απομονώθηκαν από το 2018 έως το 2021 σημειώνονται με ροζ χρώμα.

2. Ανάλυση αντιμικροβιακής αντοχής 114 απομονώσεων E. coli

Οι 114 απομονώσεις E. coli από άρρωστα γουρούνια παρουσίασαν γενικά σοβαρή πολυφαρμακευτική αντοχή (το 99,12% ήταν ανθεκτικά σε τρεις ή περισσότερες κατηγορίες φαρμάκων (Σχήμα 3Β)). Η αντοχή στην αμπικιλλίνη και τα συνδυασμένα παρασκευάσματα έφτασε το 100% και η αντοχή στην σιπροφλοξασίνη και την τετρακυκλίνη ξεπέρασε το 94% (Σχήμα 3Α). Συγκεκριμένα, το 21,05% των στελεχών ήταν ανθεκτικά στην κολιστίνη. Μετά το 2018, το ποσοστό αντοχής στην κολιστίνη (15,71%) μειώθηκε σημαντικά από την προηγούμενη περίοδο (29,55%) (όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Γ, 2018-2021). Ωστόσο, το ποσοστό αντοχής στη φλορφενικόλη αυξήθηκε στο 94,29%, ενώ τα ποσοστά αντοχής σε άλλα φάρμακα παρέμειναν σχετικά σταθερά. Αυτή η δυναμική αλλαγή μπορεί να σχετίζεται με προσαρμογές στις πολιτικές φαρμακευτικής αγωγής.

Σχήμα 3. Αντιμικροβιακή αντοχή 114 απομονώσεων E. coli

Σχήμα Α: Ποσοστά αντοχής 114 απομονώσεων σε 13 αντιβιοτικά. Σχήμα Β: Κατανομή των πολυανθεκτικών στελεχών.

Σχήμα Γ: Σύγκριση των αλλαγών στα ποσοστά αντοχής μεταξύ 2010-2017 και 2018-2021, με δοκιμές χι-τετραγώνου που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της σημασίας των διαφορών.

Συμπέρασμα: Η σοβαρή πολυφαρμακευτική αντοχή επικρατούσε στο E. coli που απομονώθηκε από άρρωστα γουρούνια στην επαρχία Zhejiang, με την αντοχή στην κολιστίνη να είναι ιδιαίτερα εμφανής. Ωστόσο, μετά την απαγόρευση το 2017, τα ποσοστά αντοχής μειώθηκαν σημαντικά, ενώ η αντοχή στη φλορφενικόλη αυξήθηκε. Αυτή η δυναμική αλλαγή σχετίζεται στενά με τις προσαρμογές στις πολιτικές χρήσης φαρμάκων.

3. Χαρακτηρισμός των γονιδιωματικών χαρακτηριστικών που σχετίζονται με την AMR σε απομονώσεις E. coli

Η μελέτη διαπίστωσε ότι οι 114 απομονώσεις E. coli από άρρωστα γουρούνια έφεραν κατά μέσο όρο 4,9 πλασμίδια, με το πλασμίδιο IncFIB να είναι το πιο συνηθισμένο (78,07% των στελεχών). Όλα τα στελέχη φιλοξενούσαν τουλάχιστον δύο γονίδια αντοχής στα φάρμακα (ARG) και το 80,7% φιλοξενούσε περισσότερα από 10 ARGs, με τα mdf(A), tet(A), floR και sul2 να είναι τα πιο διαδεδομένα. Βασικά ευρήματα αποκάλυψαν ισχυρές συσχετίσεις μεταξύ συγκεκριμένων πλασμιδίων και γονιδίων αντοχής στα φάρμακα (π.χ., τύπος IncHI2 με aadA2b/sul3/tet(A) και τύπος IncI2 με mcr-1) και πειράματα επιβεβαίωσαν ότι τα πλασμίδια IncI2 μπορούν να μεσολαβήσουν αποτελεσματικά στη μεταφορά του γονιδίου mcr-1 μεταξύ των στελεχών.

Σχήμα 4. Αποτελέσματα πρόβλεψης των αποκτηθέντων γονιδίων αντοχής σε 114 απομονώσεις Escherichia coli

Σχήμα 5. Συντελεστές συσχέτισης μεταξύ ARGs και αναπαραγωγών πλασμιδίων σε 114 απομονώσεις E. coli

Συμπέρασμα: Το E. coli από άρρωστα γουρούνια φέρει συνήθως πολλαπλά πλασμίδια και είναι εμπλουτισμένο με γονίδια αντοχής. Τα πλασμίδια IncI2 έχουν αποδειχθεί ότι είναι εξαιρετικά αποτελεσματικά διανύσματα για την οριζόντια μεταφορά του βασικού γονιδίου αντοχής mcr-1.

4. Αναγνώριση γονιδιωματικών χαρακτηριστικών που σχετίζονται με τη λοιμογόνο δράση σε απομονώσεις E. coli

Η μελέτη διαπίστωσε ότι όλες οι 114 απομονώσεις E. coli που αναλύθηκαν έφεραν τουλάχιστον ένα γονίδιο λοιμογόνου δράσης, με σχεδόν το 80% να φιλοξενεί τουλάχιστον 10. Μεταξύ αυτών, το γονίδιο terC ήταν το πιο συνηθισμένο (99,12%), ακολουθούμενο από το γονίδιο traT (81,58%). Άλλα βασικά γονίδια λοιμογόνου δράσης, stb, sta1, stx2A, stx2B και astA, εμφανίστηκαν στο 24,56% έως 36,84% των απομονώσεων. Η ανάλυση αποκάλυψε σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ συγκεκριμένων τύπων στελεχών (τύποι ST) και ορισμένων γονιδίων λοιμογόνου δράσης: Το ST501 συσχετίστηκε με τα stb και sta1, το ST100 με τα astA και stb και τα ST88 και ST4214 με τα stb, sta1, stx2A και stx2B. Επιπλέον, παρατηρήθηκαν σημαντικές σχέσεις συνύπαρξης μεταξύ των astA και stb και μεταξύ των stb, sta1, stx2A και stx2B. Η μελέτη εντόπισε επίσης 28 Escherichia coli που παράγουν τοξίνη Shiga (STEC), 43 εντεροτοξικά Escherichia coli (ETEC) και ένα EPEC-παράγοντα Escherichia coli (EPEC).

Σχήμα 6. Αποτελέσματα πρόβλεψης γονιδίων λοιμογόνου δράσης για 114 απομονώσεις E. coli

Τα κόκκινα πλέγματα υποδεικνύουν γνωστά γονίδια λοιμογόνου δράσης E. coli υψηλού κινδύνου, ενώ τα ροζ πλέγματα υποδεικνύουν κοινά γονίδια λοιμογόνου δράσης.

Συμπέρασμα: Το E. coli που απομονώθηκε από άρρωστα γουρούνια φέρει συνήθως πολλαπλά γονίδια λοιμογόνου δράσης. Συγκεκριμένοι τύποι στελεχών (όπως ST501/ST100) συσχετίζονται σημαντικά με βασικά γονίδια τοξινών και υποτύποι παθογόνων όπως STEC, ETEC και EPEC εντοπίστηκαν με επιτυχία.

5. Γονιδιωματικός χαρακτηρισμός των πλασμιδίων που φέρουν mcr-1 και mcr-3

Η μελέτη αποκάλυψε ότι δύο στελέχη E. coli φέρουν και τα δύο γονίδια mcr-1 και mcr-3. Αυτά τα γονίδια βρίσκονται σε διαφορετικά πλασμίδια: το mcr-1 βρίσκεται σε ένα πλασμίδιο IncI2, το οποίο έχει απλή δομή και υψηλό δυναμικό μετάδοσης, ενώ το mcr-3 βρίσκεται σε ένα πλασμίδιο IncHI2, το οποίο είναι σύνθετο και ποικίλο και φέρει πολλαπλά γονίδια αντοχής στα φάρμακα.

Σχήμα 7. Συγκριτική ανάλυση πλασμιδίων που φέρουν mcr και tet(X4) με προηγουμένως αναφερόμενα πλασμίδια χρησιμοποιώντας εργαλεία BLAST.

Συμπέρασμα: Τα γονίδια mcr-1 και mcr-3 στο E. coli διαπιστώθηκε ότι βρίσκονται σε δομικά απλά (IncI2) και σύνθετα (IncHI2) πλασμίδια, αντίστοιχα, υποδηλώνοντας διαφορετικούς μηχανισμούς μετάδοσης γονιδίων αντοχής.

6. Γονιδιωματικός χαρακτηρισμός των πλασμιδίων που φέρουν tet(X4)

Η μελέτη διαπίστωσε ότι δύο στελέχη E. coli ανθεκτικά στην τιγεκυκλίνη έφεραν δύο δομικά διακριτά πλασμίδια tet(X4): το μικρό πλασμίδιο p626A1-38K-tetX4 (τύπου IncX1, απλή δομή, που περιέχει tet(X4) και floR) και το μεγάλο πλασμίδιο p802A1-191K-tetX4 (σύνθετος τύπος, που περιέχει tet(X4) και πέντε άλλα γονίδια αντοχής). Και τα δύο είναι παρόμοια με τη ραχοκοκαλιά γνωστών επιδημικών πλασμιδίων και υπάρχουν κινητές περιοχές γύρω από το tet(X4) που περιέχουν πολλαπλά γονίδια αντοχής και ακολουθίες εισαγωγής, υποδηλώνοντας υψηλό κίνδυνο μετάδοσης.

Σχήμα 8. Ανάλυση του γενετικού περιβάλλοντος του γονιδίου mcr

Α: Γενετικό περιβάλλον του γονιδίου *mcr-3* σε πλασμίδια p204A1-223K-mcr3 και p602A1-220K-mcr3;

Β: Γενετικό περιβάλλον του γονιδίου *mcr-1* σε πλασμίδια p204A1-63K-mcr1 και p602A1-65K-mcr1.

Συμπέρασμα: Αυτή η μελέτη διαπίστωσε ότι τα δύο δομικά διακριτά πλασμίδια tet(X4) που φέρονται από E. coli ανθεκτικά στην τιγεκυκλίνη διαθέτουν και τα δύο χαρακτηριστικά ραχοκοκαλιάς παρόμοια με αυτά των διαδεδομένων πλασμιδίων και περιέχουν κινητές περιοχές που περιβάλλουν τα γονίδια, υποδεικνύοντας υψηλό κίνδυνο μετάδοσης.

Συμπεράσματα

Αυτή η μελέτη διαπίστωσε εκτεταμένη πολυφαρμακευτική αντοχή (συμπεριλαμβανομένων των φαρμάκων τελευταίας γραμμής) στο Escherichia coli που απομονώθηκε από άρρωστα γουρούνια στην ανατολική Κίνα. Βασικά γονίδια αντοχής, mcr-1/mcr-3/tet(X4), μεταδόθηκαν μέσω ενός σύνθετου πλασμιδίου (τύπου IncI2/IncHI2). Αυτό επιβεβαιώνει ότι τα πλασμίδια είναι τα βασικά διανύσματα της μετάδοσης αντοχής στα φάρμακα και παροτρύνει την άμεση παρέμβαση για την αποτροπή της εξάπλωσης βακτηρίων ανθεκτικών στα φάρμακα από τα ζώα στους ανθρώπους και το περιβάλλον.