O uso excessivo atual de antibióticos na medicina e na agricultura levou ao surgimento da resistência antimicrobiana, uma séria ameaça à saúde pública. No entanto, a pesquisa atual tem se concentrado em grande parte em ambientes clínicos, com pesquisa insuficiente examinando as características de resistência de Escherichia coli de animais doentes, particularmente o risco de transmissão de animais para humanos.
Recentemente, uma equipe de pesquisa do Instituto de Zootecnia e Medicina Veterinária da Academia de Ciências Agrícolas de Zhejiang e da Escola de Ciências da Vida da Universidade de Ciência e Tecnologia da China publicou um novo estudo na revista mBio. Usando tecnologia genômica, este estudo analisou a resistência a antibióticos de 114 cepas de Escherichia coli de porcos doentes coletadas ao longo de um período de 12 anos no leste da China. O estudo identificou, pela primeira vez, cepas de E. coli enterotoxigênica (ETEC) carregando os genes mcr-1 e mcr-3.
Introdução
O uso inadequado de antibióticos na pecuária e nos cuidados de saúde levou à disseminação generalizada de bactérias resistentes a medicamentos que carregam "genes de super-resistência" (como blaNDM, mcr-1 e tet(X4)). Isso enfraqueceu a eficácia dos "antibióticos de último recurso" e resultou em escassez de novos medicamentos, criando um problema sério.
E. coli, como um importante patógeno zoonótico, pode causar doenças e disseminar genes resistentes a medicamentos em ecossistemas (como aqueles que carregam os genes de alto risco blaNDM-5, mcr-1 e tet(X4/X5)). Os efeitos combinados de sua alta virulência e resistência a múltiplos medicamentos exacerbam o risco. O sequenciamento do genoma completo (WGS) é uma tecnologia chave para identificar genes de resistência a medicamentos e patogenicidade, fornecendo uma base para a prevenção e controle de doenças em animais e humanos.
Resultados da Pesquisa
1. Prevalência de Escherichia coli neste estudo
Como mostrado na Figura 1A, este estudo analisou 114 isolados de E. coli de porcos doentes e mortos de 82 fazendas em 11 cidades da província de Zhejiang entre 2010 e 2021. Esses porcos sofriam de diarreia, esplenomegalia e hepatomegalia.
Como mostrado na Figura 1B, a análise genômica revelou 39 tipos de sequência (STs), dos quais ST88 (representando 15,8%) foi o mais comum. A maior diversidade de ST foi observada em Shaoxing e Hangzhou. Múltiplos STs coexistiram ao longo dos anos e cidades. Alguns tipos de ST (como ST88) foram consistentemente prevalentes ao longo do período de nove anos, enquanto outros (como ST117 e ST48) apareceram apenas durante períodos específicos. A identificação da amostra foi confiável, e pequenas diferenças de SNP entre as cepas sugeriram possível transmissão entre fazendas e variável no tempo.
Figura 1. Características epidemiológicas de 114 isolados de Escherichia coli
Figura A: Distribuição da amostragem e tempo na província de Zhejiang (marcadores azuis)
Figura B: Associação de cepas com cidade, ano e genes de resistência a medicamentos de alto risco. A espessura da linha corresponde ao número de cepas.
Figura C: Árvore de abrangência mínima construída com base em MLST. O tamanho do nó representa o número de cepas, e o comprimento do ramo reflete a variação genética.
Conclusão: Isolados de E. coli de porcos infectados em Zhejiang exibiram alta diversidade genética (39 tipos de ST). No entanto, diferenças genéticas sutis entre as cepas também sugerem o risco de transmissão entre fazendas. A cepa ST88 demonstrou atividade epidêmica sustentada por até nove anos.
Figura 2. ANI de 114 isolados de E. coli
Os nomes das cepas de E. coli isoladas de 2010 a 2017 estão marcados em azul, e os nomes das cepas de E. coli isoladas de 2018 a 2021 estão marcados em rosa.
2. Análise de resistência antimicrobiana de 114 isolados de E. coli
Os 114 isolados de E. coli de porcos doentes geralmente exibiram resistência a múltiplos medicamentos grave (99,12% foram resistentes a três ou mais classes de medicamentos (Figura 3B)). A resistência à ampicilina e preparações combinadas atingiu 100%, e a resistência à ciprofloxacina e tetraciclina excedeu 94% (Figura 3A). Notavelmente, 21,05% das cepas foram resistentes à colistina. Após 2018, a taxa de resistência à colistina (15,71%) diminuiu significativamente em relação ao período anterior (29,55%) (como mostrado na Figura 3C, 2018-2021). No entanto, a taxa de resistência ao florfenicol aumentou para 94,29%, enquanto as taxas de resistência a outros medicamentos permaneceram relativamente estáveis. Essa mudança dinâmica pode estar relacionada a ajustes nas políticas de medicação.
Figura 3. Resistência antimicrobiana de 114 isolados de E. coli
Figura A: Taxas de resistência de 114 isolados a 13 antibióticos; Figura B: Distribuição de cepas resistentes a múltiplos medicamentos;
Figura C: Comparação das mudanças nas taxas de resistência entre 2010-2017 e 2018-2021, com testes de qui-quadrado usados para analisar a significância das diferenças.
Conclusão: A resistência grave a múltiplos medicamentos foi prevalente em E. coli isolada de porcos doentes na província de Zhejiang, com a resistência à colistina sendo particularmente proeminente. No entanto, após a proibição em 2017, as taxas de resistência diminuíram significativamente, enquanto a resistência ao florfenicol aumentou. Essa mudança dinâmica está intimamente relacionada a ajustes nas políticas de uso de medicamentos.
3. Caracterização de características genômicas associadas à RAM em isolados de E. coli
O estudo descobriu que os 114 isolados de E. coli de porcos doentes carregavam uma média de 4,9 plasmídeos, com o plasmídeo IncFIB sendo o mais comum (78,07% das cepas). Todas as cepas abrigavam pelo menos dois genes de resistência a medicamentos (ARGs), e 80,7% abrigavam mais de 10 ARGs, com mdf(A), tet(A), floR e sul2 sendo os mais prevalentes. As principais descobertas revelaram fortes associações entre plasmídeos específicos e genes de resistência a medicamentos (por exemplo, tipo IncHI2 com aadA2b/sul3/tet(A), e tipo IncI2 com mcr-1), e experimentos confirmaram que os plasmídeos IncI2 podem efetivamente mediar a transferência do gene mcr-1 entre as cepas.
Figura 4. Resultados da previsão de genes de resistência adquiridos em 114 isolados de Escherichia coli
Figura 5. Coeficientes de correlação entre ARGs e replicons de plasmídeos em 114 isolados de E. coli
Conclusão: E. coli de porcos doentes comumente carregam múltiplos plasmídeos e são enriquecidos para genes de resistência. Os plasmídeos IncI2 demonstraram ser vetores altamente eficientes para a transferência horizontal do gene de resistência chave mcr-1.
4. Identificação de características genômicas associadas à virulência em isolados de E. coli
O estudo descobriu que todos os 114 isolados de E. coli analisados carregavam pelo menos um gene de virulência, com quase 80% abrigando pelo menos 10. Entre estes, o gene terC foi o mais comum (99,12%), seguido pelo gene traT (81,58%). Outros genes de virulência chave, stb, sta1, stx2A, stx2B e astA, ocorreram em 24,56% a 36,84% dos isolados. A análise revelou correlações significativas entre tipos de cepas específicos (tipos ST) e certos genes de virulência: ST501 foi associado a stb e sta1, ST100 com astA e stb, e ST88 e ST4214 com stb, sta1, stx2A e stx2B. Além disso, relações significativas de coocorrência foram observadas entre astA e stb, e entre stb, sta1, stx2A e stx2B. O estudo também identificou 28 Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC), 43 Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e uma Escherichia coli produtora de EPEC (EPEC).
Figura 6. Resultados da previsão de genes de virulência para 114 isolados de E. coli
As grades vermelhas indicam genes de virulência de E. coli de alto risco conhecidos, enquanto as grades rosas indicam genes de virulência comuns.
Conclusão: E. coli isolada de porcos doentes comumente carrega múltiplos genes de virulência. Tipos de cepas específicos (como ST501/ST100) estão significativamente associados a genes de toxinas chave, e subtipos patogênicos como STEC, ETEC e EPEC foram identificados com sucesso.
5. Caracterização genômica de plasmídeos carregando mcr-1 e mcr-3
O estudo revelou que duas cepas de E. coli carregam os genes mcr-1 e mcr-3. Esses genes estão localizados em plasmídeos diferentes: mcr-1 está localizado em um plasmídeo IncI2, que tem uma estrutura simples e alto potencial de transmissão, enquanto mcr-3 está localizado em um plasmídeo IncHI2, que é complexo e diverso e carrega múltiplos genes de resistência a medicamentos.
Figura 7. Análise comparativa de plasmídeos carregando mcr e tet(X4) com plasmídeos relatados anteriormente usando ferramentas BLAST.
Conclusão: Os genes mcr-1 e mcr-3 em E. coli foram encontrados localizados em plasmídeos estruturalmente simples (IncI2) e complexos (IncHI2), respectivamente, sugerindo diferentes mecanismos de transmissão de genes de resistência.
6. Caracterização genômica de plasmídeos carregando tet(X4)
O estudo descobriu que duas cepas de E. coli resistentes à tigeciclina carregavam dois plasmídeos tet(X4) estruturalmente distintos: o pequeno plasmídeo p626A1-38K-tetX4 (tipo IncX1, estrutura simples, contendo tet(X4) e floR) e o grande plasmídeo p802A1-191K-tetX4 (tipo complexo, contendo tet(X4) e cinco outros genes de resistência). Ambos são semelhantes à espinha dorsal de plasmídeos epidêmicos conhecidos, e existem regiões móveis ao redor de tet(X4) contendo múltiplos genes de resistência e sequências de inserção, sugerindo um alto risco de transmissão.
Figura 8. Análise do ambiente genético do gene mcr
A: Ambiente genético do gene *mcr-3* em plasmídeos p204A1-223K-mcr3 e p602A1-220K-mcr3;
B: Ambiente genético do gene *mcr-1* em plasmídeos p204A1-63K-mcr1 e p602A1-65K-mcr1.
Conclusão: Este estudo descobriu que os dois plasmídeos tet(X4) estruturalmente distintos carregados por E. coli resistente à tigeciclina possuem características de espinha dorsal semelhantes às de plasmídeos prevalentes e contêm regiões móveis ao redor dos genes, indicando um alto risco de transmissão.
Conclusões
Este estudo descobriu resistência a múltiplos medicamentos generalizada (incluindo medicamentos de última linha) em Escherichia coli isolada de porcos doentes no leste da China. Genes de resistência chave, mcr-1/mcr-3/tet(X4), foram transmitidos via um plasmídeo complexo (tipo IncI2/IncHI2). Isso confirma que os plasmídeos são os vetores centrais da transmissão da resistência a medicamentos e insta a intervenção imediata para evitar a disseminação de bactérias resistentes a medicamentos de animais para humanos e para o meio ambiente.
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