وبلاگ در باره دانشمندان تکنیک های PCR را برای جلوگیری از آلودگی بهبود می بخشند

آیا تا به حال از نتایج غیرقابل توضیح در آزمایشات PCR خود ناامید شده اید؟ با وجود رعایت دقیق پروتکل ها، باندهای غیر اختصاصی ظاهر می شوند یا واکنش ها بیش از حد بارگذاری می شوند. مقصر ممکن است آلودگی PCR باشد - خرابکار خاموش زیست شناسی مولکولی. این دشمن نامرئی می تواند بدون هشدار آزمایشات را تضعیف کند و ساعت ها کار دقیق را به داده های غیرقابل اعتماد تبدیل کند. اما درک و جلوگیری از آلودگی می تواند دقت را به نتایج شما بازگرداند.

آلودگی PCR زمانی رخ می دهد که DNA خارجی به طور تصادفی وارد فرآیند تکثیر شود. این آلودگی ها می توانند از نمونه ها، معرف ها، تجهیزات آزمایشگاهی یا حتی خود محققان (از طریق سلول های پوستی یا سلول های مخاطی) نشأت بگیرند. پس از معرفی، این توالی های DNA خارجی به اهداف تکثیر تبدیل می شوند و نتایج مثبت کاذب ایجاد می کنند که اعتبار آزمایش را به خطر می اندازد.

کنترل موثر آلودگی نیازمند اقدامات سیستماتیک در طول گردش کار آزمایشی است - یک طرح نبرد جامع در برابر مهاجمان مولکولی.

• عملیات منطقه بندی شده: مناطق کاری به وضوح جداگانه ایجاد کنید: "مناطق تمیز" برای آماده سازی معرف ها، "مناطق نیمه آلوده" برای دستکاری نمونه ها، و "مناطق آلوده" برای تکثیر. تجهیزات و پرسنل نباید بین مناطق عبور کنند.
• استریلیزاسیون UV: به طور منظم سطوح کار، سانتریفیوژها، پیپت ها و دستگاه های PCR را با نور UV تابش دهید تا DNA باقیمانده را تجزیه کند.
• فشار هوای مثبت: جریان هوای آزمایشگاه را به سمت بیرون حفظ کنید تا از ورود آلودگی های محیطی جلوگیری شود.
• حفاظت شخصی: روپوش آزمایشگاهی، دستکش و ماسک بپوشید. دستکش ها را به طور مرتب عوض کنید، به خصوص بین دستکاری نمونه ها یا معرف های مختلف.

• معرف های کنترل کیفیت شده: از کیت های تجاری PCR که فاقد DNase هستند استفاده کنید. برای آماده سازی های داخلی، از تکنیک های استریل استفاده کنید و با DNase تیمار کنید.
• لوازم مصرفی تخصصی: فقط از لوله ها، نوک ها و پلیت های گواهی شده فاقد DNase/RNase استفاده کنید. هرگز با ظروف پلاستیکی استاندارد جایگزین نکنید.
• استراتژی آلیقات: معرف های حجیم را در قسمت های تک استفاده در شرایط استریل تقسیم کنید تا فرصت های آلودگی به حداقل برسد.

• پیپتینگ رو به جلو: همیشه نوک پیپت را در حین انتقال به سمت بالا نگه دارید تا از برگشت مایع به داخل پیپت جلوگیری شود.
• نوک های فیلتردار: از نوک پیپت های مقاوم در برابر آئروسل برای مهار گسترش احتمالی آلودگی استفاده کنید.
• واکنش های کنترلی: هم کنترل های مثبت (با DNA هدف شناخته شده) و هم کنترل های منفی (بدون الگو) را در هر اجرا بگنجانید. سیگنال تکثیر کنترل منفی نشان دهنده آلودگی است که نیاز به بررسی فوری دارد.

• تمیز کردن سیستماتیک: به طور منظم تمام سطوح کار، تجهیزات و کف ها را با محلول های مناسب ضدعفونی کنید.
• پاکسازی آنزیمی: مواد مشکوک آلوده را با DNase I تیمار کنید تا DNA ناخواسته را تجزیه کند.

آلودگی PCR، اگرچه قابل توجه است، اما شکست ناپذیر نیست. از طریق کنترل کیفیت دقیق، تکنیک منظم و هوشیاری مداوم، محققان می توانند این تهدید نامرئی را خنثی کنند. اجرای این اقدامات نتایج تکثیر قابل اعتماد را تضمین می کند و پایه ای برای نتیجه گیری های علمی قوی فراهم می کند.