Blog về Hướng dẫn làm chủ bộ kit giải trình tự DNA Sanger

Trong bối cảnh rộng lớn của nghiên cứu về gen, công nghệ trình tự DNA đóng một vai trò quan trọng.Một thành phần quan trọng của kỹ thuật này ✓ trình tự chu kỳ ✓ cho phép khuếch đại tuyến tính của các mảnh DNA mục tiêu thông qua biến dạng lặp đi lặp lại, lò sưởi, và phản ứng mở rộng trong một chu trình nhiệt, tiếp theo là phân tích điện phân mạch mao.được xây dựng trên khuôn khổ trình tự chu kỳ mạnh mẽ này, cung cấp cho các nhà nghiên cứu các giải pháp đa dạng phù hợp với các nhu cầu thử nghiệm khác nhau.

Cơ sở hóa học của trình tự Sanger: Dye Primer so với Dye Terminator

Chuỗi Sanger dựa trên hai chiến lược hóa học chính: hóa học chất khởi tạo thuốc nhuộm và hóa học chất kết thúc thuốc nhuộm.Hiểu được sự khác biệt và lợi thế của chúng là rất quan trọng để chọn bộ thứ tự tối ưu.

• Hóa học chất tạo màu:Các thuốc nhuộm huỳnh quang được gắn vào các chất khởi tạo thứ tự. Trong quá trình mở rộng bằng DNA polymerase, mỗi sản phẩm mang một tín hiệu huỳnh quang tương ứng với cơ sở kết thúc của nó.Cách tiếp cận này xuất sắc trong trình tự độ phân giải cao gần các vùng liên kết Primer.
• Dye Terminator Chemistry:Phương pháp hiện đại chiếm ưu thế, trong đó thuốc nhuộm huỳnh quang được kết hợp với các chất chấm dứt chuỗi (ddNTPs).Việc kết hợp một ddNTP ngăn chặn sự kéo dài trong khi phát ra một tín hiệu huỳnh quang cụ thể, cho phép xác định trình tự thông qua phân tích chiều dài mảnh.

Bộ reagent BigDye®: Chọn chính xác cho nhiều ứng dụng khác nhau

Dòng BigDye® của Thermo Fisher Scientific cung cấp các giải pháp chuyên biệt cho các nhu cầu thứ tự khác nhau.

* Khi sử dụng polyme POP-6TM
† Yêu cầu M13-tail primer trong quá trình khuếch đại PCR

Ưu điểm chiến lược của các chất khởi tạo phổ quát

Việc kết hợp M13 hoặc các bộ khởi tạo đuôi phổ quát khác hợp lý hóa quy trình làm việc bằng cách tiêu chuẩn hóa các quy trình nhân bản và trình tự, giảm sự biến đổi quy trình.

Ứng dụng chính và tiêu chí lựa chọn bộ

1. Tái phân loại sản phẩm PCR

Được sử dụng để phát hiện biến thể so với chuỗi tham chiếu, ứng dụng này được hưởng lợi từ các bộ dụng cụ có khả năng gọi cơ sở đầu tiên và phát hiện cơ sở hỗn hợp mạnh mẽ.Xếp thứ tự hai chiều của các mảnh PCR đảm bảo dữ liệu chất lượng cao.

2. NGS Validation

Chuẩn kế Sanger là tiêu chuẩn vàng để xác nhận kết quả trình tự thế hệ tiếp theo, đặc biệt là để xác minh các vùng mục tiêu được khuếch đại bằng PCR.

3Phân tích Methylation

Chuyển đổi bisulfite phân biệt các cytosine được methyl hóa (được giữ lại là C) với các cytosine không methyl hóa (được chuyển đổi thành T).Các chiến lược bao gồm trình tự trực tiếp của các sản phẩm PCR xử lý bisulfite hoặc phân tích phân mảnh nhân bản.