bedrijfsnieuws over Laatste onderzoek. Evolutie van genetica en pathogeniteit van hoog pathogene varkens.

In 2006 veroorzaakte HP-PRRSV, dat uit de klassieke PRRSV evolueerde, een epidemie in China die gekenmerkt werd door hoge koorts, ziekte en sterfte.de stam verspreidde zich over China en AziëHet HP-PRRSV en zijn varianten zijn de dominante stammen in China geworden, maar onderzoek naar epidemiologische patronen, moleculaire evolutie,en pathogeniteit van de nieuwe L8.7 PRRSV blijft beperkt.

Op 22 mei 2025, a study titled "Genetic Evolution and Pathogenic Variation of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus" published in the journal Taylor & Francis systematically explained the epidemic dynamics, evolutionaire trends, vaccinstam-associaties en pathogeniteits-evolutioneisen van de L8.7 lijn.

Deze studie biedt belangrijke gegevens om strategieën voor de preventie en bestrijding van L8.7 PRRSV te ontwikkelen.

Abstract

Op basis van de analyse van 2.509 wereldwijde L8.7 ORF5-gensequenties werd de L8.7-lijn in zeven groepen (L8.7.1-L8.7.7). L8.7.1-L8.7.3 overeenkomen met de gerapporteerde klassieke PRRSV, tussenstammen en HP-PRRSV, respectievelijk, terwijl L8.7.4-L8.7.7 worden gedefinieerd als HP-achtige PRRSV's.

Statistische analyses toonden aan dat HP-achtige PRRSV' s binnen de L8.7-lijn overheerste, met L8.7.5 en L8.7Een uitgebreide analyse van het gehele genoom heeft aangetoond dat 72,15% van de L8,7-stammen kenmerken van het wilde type vertoonde.
De evolutionaire snelheidsanalyse toonde aan dat de evolutionaire snelheid van de L8.7.3-L8.7.7 afstammelingen in China is ongeveer 4,1-voudig gedaald sinds de introductie van het attenueerde HP-PRRSV-vaccin (MLV).

Pathogeniteitstests toonden aan dat, vergeleken met HP-PRRSV (L8.7.3: HuN4), HP-PRRSV-achtige stammen (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) een hoge virulentie behouden en tegelijkertijd een verminderde pathogeniteit bij biggen vertonen.

# Grafische Abstract

Experimentele resultaten

# Classificatie van L8.7 PRRSV

Om de evolutionaire kenmerken van PRRSV L8 te analyseren.7, werd in dit onderzoek in totaal 2509 ORF5-sequenties geanalyseerd: 2159 L8.7 stamsequenties werden verkregen uit de NCBI-database,en 350 sequenties werden verzameld in ons laboratorium tussen 2014 en 2023 (figuur 1 ((a))Zoals in de figuur wordt weergegeven, werden de L8.7 stammen verder onderverdeeld in zeven groepen (L8.7.1 ¢8.7.7) (figuur 1 (a, b)); alle volgorde-informatie is beschikbaar (figuur 2).

Zoals in figuur 1b is aangetoond, zijn de referentiestammen die zijn gebruikt voor de constructie van de phylogenetische boom afkomstig van bekende klassieke stammen en L8.7 PRRSV-stammen die in pathogeniteitsstudies zijn gemeld.De gemiddelde genetische afstanden binnen en tussen de groepen worden weergegeven in figuur 1 (c).Met uitzondering van L8.7.2In het algemeen lagen de genetische afstanden tussen de groepen tussen 4,3% en 10,4%.7.4-L.7.7 stammen vertoonden specifieke aminozuurmutatiepatronen met verschillende kenmerken en werden gedefinieerd als HP-PRRSV-achtig.23% (56/2509) behoorde tot L8.7.1 (CH-1a-achtige PRRSV), 4,74% (119/2509) tot L8.7.2 (intermediate PRRSV), 11,48% (288/2509) tot L8.7.3 (HP-PRRSV) en 81,54% (2046/2509) aan HP-PRRSV-achtig.

Figuur 1 Phylogenetische boom en nucleotide-identiteitsanalyse van L8.7 stammen

(a) Phylogenetische boom die L8.7 sequenties in zeven groepen verdeelt. (b) Phylogenetische boom die is geconstrueerd op basis van het ORF5-gen van L8.7 PRRSV-isolaten en referentiestammen van PRRSV uit elke afstamming.De in dit onderzoek gebruikte experimentele stammen zijn gemarkeerd met gele sterren.. c) Genetische afstanden binnen en tussen L8.7 stamgroepen (percentage nucleotideverschillen).

Figuur 2 Vergelijkende analyse van de pathogeniteit van PRRSV L8.7.1-L8.7.7

# Wereldwijde verspreiding van PRRSV L8.7

Deze studie analyseerde uitgebreid L8.7-sequenties waarvoor tijds- en geografische informatie bekend is.7.4 was het meest verspreid en bestond uit acht van de negen landen waar L8.7 stammen werden aangetroffen (figuur 3 ((a, b)).7.4; er werden geen andere groepen gevonden.7.1, 8.7.3, 8.7.5, 8.7.6, en 8.7.7 stammen werden gevonden in respectievelijk twee, drie, vier, vier en twee landen (figuur 3 ((a, b)).7Het aantal (2201/2509, 87,7%) en de diversiteit (7/7 groepen, 100%) van de L8,7 PRRSV-stammen in China stond op de eerste plaats (figuur 3 ((b)).

Figuur 3 a) Geografische verdeling van L8.7 stammen in verschillende regio's van de wereld Figuur 3 b) Nationale verdeling van L8.7 stammen.

Deze studie analyseerde in totaal 2.201 L8.7 PRRSV-stammen uit China. L8.7 PRRSV-infectie is gemeld in 26 provincies in China, waarbij de provincie Guangdong de meeste gevallen meldde,gevolgd door GuangxiDe prevalentie van verschillende PRRSV-groepen in China vertoont tijdsdynamiek (figuur 3 (e)).met duidelijke pieken in prevalentie in specifieke groepen- Groepen L8.7.1 en L8.7.2 zijn met zeer lage frequenties ontdekt en sinds 2006 zelden gemeld.7.3, na een uitbraak in 2006 te hebben veroorzaakt, domineerde en bleef bestaan van 2006 tot 2009.

Figuur 3 (c) Geografische verdeling van L8.7 stammen in verschillende regio's van China Figuur 3 (d) Populatieverdeling van L8.7 stammen in verschillende provincies van China

HP-achtige PRRSV's (L8.7.4-8.7.7) hebben HP-PRRSV geleidelijk vervangen als de overheersende circulerende stammen in China (figuur 3 (e)).7.4 werd voor het eerst gerapporteerd en gecontroleerd in China in 2006 en vertegenwoordigde een aanzienlijk deel van de L8.7-stammen in China tussen 2009 en 2011 (41,3%-79,6%).sommige groepen hebben plotselinge toenames van de prevalentie ervaren: bijvoorbeeld groep L8.7.5In China is de prevalentie sinds 2011 aanzienlijk toegenomen (17,1%-51,6%) (figuur 3).7Deze groep (EU709835.1, SH02) werd voor het eerst geïdentificeerd in 2002. Aanvankelijk was het detectiepercentage extreem laag (slechts één stam) en werd het niet gedetecteerd tussen 2003 en 2005.de prevalentie is geleidelijk gedaald tot 2009Het werd vervolgens de overheersende stam tussen 2014 en 2023, met een aandeel van 21,5% tot 47,1%.7.6 werd het vaakst gedetecteerd in China (612/2201, 27,8%) en had de breedste verspreiding (20/21 provincies, 95,2%) (figuur 3 ((d, f)).7.7 werd voor het eerst gedetecteerd in 2008, maar de prevalentie bleef laag tot 2011, waarna het geleidelijk toenam.

Figuur 3 (e) Verdeling van L8.7-stammen in de tijd op basis van ORF5-sequenties Figuur 3 (f) Stapelde balkgrafiek van relatieve frequenties in China.

Deze resultaten tonen aan dat L8 in het afgelopen decennium7.5 en L8.7.6 stammen waren niet alleen de meest voorkomende, maar ook de meest verspreide in China.

# Relatie tussen HP-PRRSV MLV's en HP-PRRSV's
Om het verband tussen HP-PRRSV-afgezwakt vaccins (JXA1-R, HuN4-F112, TJM-F92, GDr180) en HP-PRRSV-achtige stammen te onderzoeken, werd in dit onderzoek de stammen van de L8 uitgebreid geanalyseerd.7.48.7.7 afstammingen op basis van nucleotide-identiteit, NSP2-delectie-signaturen en genomeel kenmerkende aminozuurveranderingen (tabel 1).

Tabel 1 Genome-wide-associatie analyse tussen HP-PRRSV attenueerd vaccin (MLV) en HP-PRRSV-achtige stammen

De resultaten wijzen uit dat de sleutel tot het onderscheiden van vaccine-achtig PRRSV van HP-PRRSV-achtige stammen niet kan worden bepaald door nucleotide-identiteit van het gehele genoom of kenmerkende aminozuurveranderingen,In de eerste plaats is het niet mogelijk om de NSP2 te verwijderen, maar door de aanwezigheid van aanvullende NSP2-verwijderingen (tabel 1)Uit statistische analyses bleek dat 27,85% (22/79) van de L8.7.6 afstammingsstammen werden geassocieerd met het vaccin.

Pathogeniteit van HP-PRRSV- en HP-PRRSV-achtige stammen bij biggen

# Isolatie en identificatie van dominante HP-PRRSV-achtige stammen

Systematisch de pathogeniteit van de dominante HP-PRRSV-achtige stammen (L8.7.5 en L8.7.6), heeft dit onderzoek de L8 met succes geïsoleerd.7.5 afstammingsstam DLF en L8.7Deze virussen werden geïsoleerd uit varkensalveolaire macrophagen (PAM's) en Marc-145-cellen.De IFA-analyse toonde aan dat PRRSV M-eiwitexpressie werd waargenomen in PAM's en Marc-145-cellen die met de stam waren ingeënt (figuur 4 ((a)))., waaruit blijkt dat de stammen DLF en DLW met succes zijn gescheiden.

Figuur 4 Isolatie, kweek, recombinatie-analyse en kenmerkende aminozuuraanpassing van de stam L8.7 met NSP2

a) Identificatie van de stammen DLW en DLF.Immunofluorescentie (IFA) met behulp van een monoclonaal antilichaam gericht op het PRRSV M-eiwit onthulde specifieke reactiviteit in PAM's en Marc-145-cellen van de controlepers.(b) Analyse van recombinatiegebeurtenissen bij DLW.(c) Uitlijning van de afgeleide aminozuursequenties van de NSP2-eiwitten van de L8.7 stammen.

# Genomische kenmerken van DLF en DLW

De volledige genoomlengtes van DLF (PQ178809) en DLW (PQ178810) zijn respectievelijk 15.324 en 15.323 nucleotiden (exclusief de poly(A) staart).HuN4/DLW en DLF/DLW waren 98.67%, 95,78% en 95,13% respectievelijk (zoals weergegeven in de onderstaande tabel).

De sequentie-uitlijning van het NSP2-eiwit onthulde dat DLF en DLW discontinue deleties vertoonden van 30 aminozuren (1 + 29 aminozuren) op de posities 482 en 533-561 in het CH-1a-stam NSP2-eiwit..Dit patroon is consistent met dat van L8.7.3 (HP-PRRSV) (figuur 4 (c)). Om na te gaan of DLF en DLW betrokken waren bij een recombinatiegebeurtenis,Een analyse met SimPlot en RDP4-software toonde aan dat DLW een recombinatie-evenement onderging (recombinatie-locaties van nt 3500-5657)Op basis van beide eerdere studies en de in deze studie gebruikte criteria om vaccinstammen te onderscheiden van wildsoortstammen, waren zowel DLF als DLW wildsoortstammen.

# Klinische tekenen van geïnfecteerde biggen
De proefprocedure is weergegeven in figuur 5 (a).

Bij biggen in de HuN4- en DLF-uitdagingsgroepen ontwikkelden beide klaarblijkelijke klinische symptomen (hoest, lethargie, indigestie en rillingen) 2 dagen na blootstelling.De proefgroep DLW vertoonde tot 3 dagen na de blootstelling typische klinische tekenen van PRRSV-infectie.In de HuN4 uitdagingsgroep bleven varkens met een hoge koorts (≥ 40 °C) leven.5°C) gedurende 4­6 dagen (figuur 5 (b)) en begon 12 dagen na blootstelling te sterven., met een overlevingspercentage van 20% 21 dagen na blootstelling (figuur 5 (c)).met een overlevingspercentage van 60% 21 dagen na blootstelling (figuur 5 ((c))Ondanks een lager sterftecijfer was de duur van de koorts in deze groep langer (7­15 dagen) (figuur 5b).met een kortere koortsduur (1 ¢ 8 dagen) (figuur 5 (b))De biggen in de controlegroep vertoonden geen duidelijke klinische symptomen en overleefden de gehele studie (figuur 5 (b, c)).

Figuur 5 (b) Rectale temperatuurtendensen na de test met DLF, DLW en HuN4.

Figuur 5 (c) Overlevingspercentages na uitdaging met DLF, DLW en HuN4.

Het gewicht van de biggen werd gemeten op 0, 7, 14 en 21 dpi.Statistische analyses toonden aan dat de gemiddelde dagelijkse gewichtstoename (ADG) van biggen in de groep met DLF significant lager was dan die van niet-geïnfecteerde biggen van 1 tot 7 dpi.In vergelijking met niet-geïnfecteerde biggen was de ADG van biggen in de groep met HuN4-uitdaging significant lager, van 8 tot 14 dpi.terwijl de ADG van biggen in de groep met een DLW-uitdaging aanzienlijk lager was van 8 tot 14 en van 15 tot 21 dpi (figuur 5 ((d)).

Figuur 5 (d) Gemiddelde veranderingen in dagelijkse gewichtstoename in de DLF-, DLW- en HuN4-probleemgroepen

De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking (foutbalken). :p<0.05; :p<0.01; :p<0.001; ****:p<0.0001; ns: niet statistisch significant.

# Dynamische veranderingen in PRRSV-specifieke antilichamen
Van alle varkens werden bloedmonsters verzameld bij 0, 3, 5, 7, 10, 14 en 21 dpi, en met behulp van een commerciële ELISA-kit werden specifieke antilichamen tegen het PRRSV N-eiwit gedetecteerd.De resultaten toonden aan dat PRRSV-specifieke antilichamen (S/P-verhouding ≥.4) werden gedetecteerd bij biggen in de DLF- en HuN4-gecontroleerde groepen bij 10 dpi. Bij 14 dpi waren alle vijf biggen in de DLW-gecontroleerde groep antistofpositief (S/P-verhouding ≥ 0,4).De S/P-ratio's in de in vraag gestelde groepen bleven stijgen tot het einde van het experiment, terwijl er tijdens het hele experiment geen PRRSV-specifieke antilichamen werden gedetecteerd in de onbevooroordeelde groep (figuur 5 ((e)).

# Beoordeling van viremie en virale lading in verschillende weefsels

Omgekeerde transcriptie kwantitatieve polymerase kettingreactie (RT-qPCR) werd gebruikt om de virale ladingverdeling in serummonsters en 10 weefsels die bij autopsie werden verkregen op 0, 3, 5, 7, 10, 14, 15 en 16 uur te analyseren.en 21 dagen na de uitdagingDe resultaten toonden aan dat de viremie niveaus in de uitgedaagde groepen begonnen te stijgen op 3 dagen na de uitdaging.de piek op 5 dagen na de uitdaging in de DLF- en DLW-groepen en op 7 dagen na de uitdaging in de HuN4-groep (figuur 5))Er werden significante verschillen in viremiegehalte waargenomen tussen de geteste groepen van 7 tot 10 dagen na de test (figuur 5).Viremie werd niet gedetecteerd in de controlegroep gedurende de gehele uitdagingsperiode.Hoewel verschillen in virale lading in dezelfde weefsels werden waargenomen tussen de onderzochte groepen, waren deze verschillen niet statistisch significant (figuur 5 ((g)).ORF7-gensequencing bevestigde dat de monsters de oorspronkelijke uitdagingsstam bevatten.

Figuur 5 (f) Dynamische veranderingen in viremie veroorzaakt door DLF, DLW en HuN4

Figuur 5 (g) Analyse van de virale lading in verschillende weefsels van de DLF-, DLW- en HuN4-uitdagingsgroepen

Grote en histopathologische laesies
Alle HuN4-geïnfecteerde biggen vertoonden ernstige thymatrofie (figuur 6 ((a)).Overwegende dat in de groep met DLW-problemen geen thymatrofie werd waargenomen (figuur 6b), c)).
Alle vijf varkens in de groep met HuN4-uitdaging vertoonden consolidatie van de longen (figuur 6 ((e))), waarvan vier een bloeding van de mandibulaire lymfeklieren hadden (figuur 6 ((m)).drie hadden longconsolidatie (figuur 6) en drie hadden mandibulaire lymfeklierbloeding (figuur 6)Twee van de vijf varkens in de DLW-groep vertoonden consolidatie van de longen (figuur 6 (g)) en twee varkens hadden een lichte bloeding in de mandibulaire lymfeklieren (figuur 6 (o)).Er werden geen significante pathologische veranderingen waargenomen in het orgaantweefsel van de niet-geïnfecteerde biggen (figuur 6)), h, p)).

Bij varkens die met HuN4 werden getest, ontstond ernstige interstitiële longontsteking met bloeding (figuur 6 ((i))), gekenmerkt door verdikking van het alveolaire septum en infiltratie van mononucleaire cellen.Microscopische laesies in de longen van de DLF- en DLW-groepen waren vergelijkbaar.De DLF-geconfronteerde groep vertoonde uitgebreide ontstekingscelinfiltratie met serosoos exsudaat, necrose en peeling van alveolaire epitheelcellen.en significante necrose en exfoliatie van bronchiale epitheelcellen (figuur 6 ((j))De DLW-groep toonde uitgebreide ontstekingscelinfiltratie en matige verruiming van het alveolaire septum (figuur 6 (k)).de onderzochte groepen vertoonden verschillende graden van medullaire bloeding in de mandibulaire lymfeklieren (figuur 6 ((q-t)), terwijl bij de controlevarkens geen pathologische laesies in deze weefsels werden waargenomen (figuur 6 (i,t)).

Figuur 6 Grote en histologische longlaesies in verschillende uitdagingsgroepen

Bij varkens die met HuN4 of DLF werden getest, werden verschillende graden van thymusatrofie aangetoond (a, b).De HuN4- en DLF-infectiegroepen ontwikkelden ernstige interstitiële longontsteking met pulmonale consolidatie (e, f) en lymfeklierbloeding (i, j), terwijl de DLW-infectiegroep mildere interstitiële longontsteking vertoonde met longconsolidatie (g) en lymfeklierbloeding (o).Lungeweefsels van de onderzochte groepen vertoonden verschillende graden van interstitiële longontsteking., gekenmerkt door uitgebreide ontstekingscelinfiltratie, alveolaire epitheelhyperplasie en verruiming van de alveolaire septum (i-k).medullaire bloedingen werden waargenomen in de mandibulaire lymfeklieren van de onderzochte groepen (q-t), maar niet in de controlegroep (r).

Conclusies

De L8.7-lijn is de vroegste PRRSV-lijn die in China werd ontdekt en circuleert al meer dan 25 jaar.veroorzaakt een epidemie in China gekenmerkt door hoge koortsIn het verleden werd de ziekte in de Verenigde Staten in de Verenigde Staten en in de Verenigde Staten onder meer in de Verenigde Staten en in de Verenigde Staten aangetroffen.HP-PRRSV en zijn varianten zijn de dominante stammen in China geworden, maar onderzoek naar de epidemiologische patronen, moleculaire evolutie en pathogeniteit van het nieuwe L8.7 PRRSV blijft onderontwikkeld.7 PRRSV en een uitgebreide en systematische analyse.

De aandacht voor L8.7-stammen is vooral gericht op hun pathogeniteit, met name sinds de uitbraak van 2006 veroorzaakt door de L8-stam.7.3 stam (HP-PRRSV). Daarom is dit onderzoek gericht op het isoleren en evalueren van de pathogeniteit van de meest dominante HP-PRRSV-achtige stammen (L8.7.5: DLF; L8.7.6De resultaten toonden aan dat, hoewel de virulentie van HP-PRRSV-achtige stammen (DLF en DLW) was verminderd in vergelijking met HP-PRRSV (HuN4) (zoals blijkt uit een verhoogde overleving van biggen), de virulentie van de HP-PRRSV-achtige stammen (DLF en DLW) in vergelijking met de HP-PRRSV (HuN4) (zoals blijkt uit een verhoogde overleving van biggen) was verminderd.verhoogde dagelijkse gewichtstoename, verlaagde koortstemperatuur en -duur, en verschillen in thymusatrofie), vertoonden ze nog steeds een significante pathogeniteit.Virulentie in dit onderzoek werd gecorreleerd met de serumvirale lading bij geteste biggen op 7 en 10 dagen na de inentingDaarom is het overlevingspercentage, koortstemperatuur en -duuren thymatrofie zijn belangrijke indicatoren van de pathogeniteit van PRRSV bij biggen.