Unternehmensnachrichten über Neueste Forschung | Entwicklung der Genetik und Pathogenität des hochpathogenen Porcinen Reproduktions- und Atemwegssyndroms

Im Jahr 2006 verursachte HP-PRRSV, das sich aus dem klassischen PRRSV entwickelte, eine Epidemie in China, die sich durch hohes Fieber, Morbidität und Sterblichkeit auszeichnete.Der Stamm verbreitete sich in ganz China und AsienHP-PRRSV und seine Varianten sind in China zu den dominierenden Stämmen geworden.und Pathogenität des neuen L8.7 PRRSV bleibt begrenzt.

Am 22. Mai 2025 a study titled "Genetic Evolution and Pathogenic Variation of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus" published in the journal Taylor & Francis systematically explained the epidemic dynamics, evolutionäre Trends, Assoziationen von Impfstoffstämme und evolutionäre Gesetze der L8.7-Linienpathogenität.

Diese Studie liefert wichtige Datenunterstützung für die Entwicklung von Strategien zur Prävention und Bekämpfung von L8.7 PRRSV.

Abstract

Basierend auf der Analyse von 2.509 globalen L8.7 ORF5-Gensequenzen wurde die L8.7-Linie in sieben Gruppen (L8.7.1-L8.7.7). L8.7.1-L8.7.3 entsprechen den gemeldeten klassischen PRRSV, Zwischenstämmen und HP-PRRSV, während L8.7.4-L8.7.7 sind als HP-ähnliche PRRSV definiert.

Statistische Analysen zeigten, dass HP-ähnliche PRRSVs innerhalb der L8.7-Linien vorherrschten, wobei L8.7.5 und L8.7Eine umfassende Analyse des gesamten Genoms ergab, dass 72,15% der L8.7-Stämme wildartige Merkmale aufwiesen.
Die Analyse der Evolutionsgeschwindigkeit ergab, dass die Evolutionsgeschwindigkeit der L87.3-L8.7.7 Abstammungslinien in China sind seit Einführung des abgeschwächten HP-PRRSV-Impfstoffs (MLV) um etwa das 4,1-fache zurückgegangen.

Die Pathogenitätstests ergaben, dass im Vergleich zu HP-PRRSV (L8.7.3: HuN4), HP-PRRSV-ähnliche Stämme (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) eine hohe Virulenz beibehalten und bei Ferkeln eine reduzierte Pathogenität aufweisen.

# Graphische Abstraktion

Versuchsergebnisse

# Klassifizierung von L8.7 PRRSV

Um die evolutionären Merkmale von PRRSV L8 zu analysieren.7In dieser Studie wurden insgesamt 2509 ORF5-Sequenzen analysiert: 2159 L8.7-Stammsequenzen wurden aus der NCBI-Datenbank gewonnen.und 350 Sequenzen wurden in unserem Labor zwischen 2014 und 2023 gesammelt (Abbildung 1 ((a))Wie in der Abbildung dargestellt, wurden die L8.7-Stämme in sieben Gruppen (L8.7.1 ¢8.7.7) (Abbildung 1 (a, b)); alle Sequenzinformationen sind verfügbar (Abbildung 2).

Wie in Abbildung 1 (b) dargestellt, stammten die zur Erstellung des phylogenetischen Baumes verwendeten Referenzstämme aus bekannten klassischen Stämmen und L8.7 PRRSV-Stämmen, die in Krankheitserregerstudien berichtet wurden.Die durchschnittlichen genetischen Abstände innerhalb und zwischen den Gruppen sind in Abbildung 1 (c) dargestellt.Mit Ausnahme von L8.7.2In den Niederlanden lag die durchschnittliche genetische Distanz in allen Gruppen bei weniger als 5%, insgesamt lag die genetische Distanz zwischen den Gruppen zwischen 4,3% und 10,4%.7.4-L.7.7 Stämme zeigten spezifische Aminosäuremutationsmuster mit unterschiedlichen Eigenschaften und wurden als HP-PRRSV-ähnlich definiert.23% (56/2509) gehörten zu L8.7.1 (CH-1a-ähnlicher PRRSV), 4,74% (119/2509) bis L8.7.2 (zwischenrangiges PRRSV), 11,48% (288/2509) bis L8.7.3 (HP-PRRSV) und 81,54% (2046/2509) zu HP-PRRSV-ähnlich.

Abbildung 1 Phylogenetikbaum und Nukleotididentitätsanalyse von L8.7-Stämmen

(a) Phylogenetikbaum, der L8.7-Sequenzen in sieben Gruppen unterteilt. (b) Phylogenetikbaum, der auf der Grundlage des ORF5-Gens von L8.7-PRRSV-Isolaten und Referenz-PRRSV-Stämmen aus jeder Linie konstruiert wurde.Die in dieser Studie verwendeten Versuchsstämme sind mit gelben Sternen gekennzeichnet.c) Genetische Abstände innerhalb und zwischen den L8.7-Stammgruppen (Prozentsatz der Nukleotiddifferenzen).

Abbildung 2 Vergleichende Analyse der Pathogenität von PRRSV L8.7.1-L8.7.7

# Globale Verteilung von PRRSV L8.7

Diese Studie analysierte umfassend L8.7-Sequenzen, für die zeitliche und geografische Informationen bekannt sind.7.4 war die am weitesten verbreitete, in acht der neun Länder, in denen L8.7-Stämme gefunden wurden (Abbildung 3 ((a, b)).7.4■ keine anderen Gruppen gefunden wurden.7.1, 8.7.3, 8.7.5, 8.7.6, und 8.7.7 Stämme wurden in zwei, drei, vier, vier und zwei Ländern gefunden (Abbildung 3 (a, b)).7Die Zahl (2201/2509, 87,7%) und die Vielfalt (7/7 Gruppen, 100%) der L8,7-PRRSV-Stämme in China belegten den ersten Platz (Abbildung 3 ((b)).

Abbildung 3 a) Geographische Verteilung der L8.7-Stämme in verschiedenen Regionen der Welt Abbildung 3 b) Nationale Verteilung der L8.7-Stämme.

Diese Studie analysierte insgesamt 2.201 L8.7 PRRSV-Stämme aus China. Eine L8.7 PRRSV-Infektion wurde in 26 Provinzen in China gemeldet, wobei die Provinz Guangdong die meisten Fälle berichtete.gefolgt von GuangxiDie Prävalenz verschiedener PRRSV-Gruppen in China zeigt zeitliche Dynamik (Abbildung 3 e).mit ausgeprägten Spitzen der Prävalenz in bestimmten Gruppen- Gruppen L8.7.1 und L8.7.2 wurden in sehr geringen Mengen festgestellt und seit 2006 nur selten gemeldet.7.3, nachdem sie 2006 einen Ausbruch verursacht hatte, dominierte und hielt sich von 2006 bis 2009 an.

Abbildung 3 (c) Geographische Verteilung der L8.7-Stämme in verschiedenen Regionen Chinas Abbildung 3 (d) Bevölkerungsverteilung der L8.7-Stämme in verschiedenen Provinzen Chinas

HP-ähnliche PRRSVs (L8.7.4 bis 8.7.7) haben HP-PRRSV als vorherrschende zirkulierende Stämme in China allmählich ersetzt (Abbildung 3 (e)).7.4 wurde erstmals 2006 in China gemeldet und überwacht und machte zwischen 2009 und 2011 einen erheblichen Anteil der L8.7-Stämme in China aus (41,3%-79,6%).Einige Gruppen erlebten plötzliche Zunahmen der Prävalenz.: zum Beispiel Gruppe L8.7.5Die Zyklen des L8 haben sich seit 2011 deutlich erhöht (17,1%-51,6%) (Abbildung 3 f).7.6 Stamm ist ebenfalls bemerkenswert.1, SH02) wurde erstmals 2002 identifiziert.Anfangs war die Erkennungsrate extrem niedrig (nur ein Stamm), und zwischen 2003 und 2005 wurde sie nicht nachgewiesen.bis 2009 allmählich zurückgegangenEs wurde dann der vorherrschende Stamm zwischen 2014 und 2023, was 21,5% bis 47,1% ausmacht.7.6 wurde am häufigsten in China (612/2201, 27,8%) festgestellt und hatte die breiteste Verteilung (20/21 Provinzen, 95,2%) (Abbildung 3 ((d, f)).7.7 wurde erstmals im Jahr 2008 festgestellt, aber seine Prävalenz blieb bis 2011 niedrig, danach stieg sie allmählich an.

Abbildung 3 e) Verteilung der L8.7-Stämme im Laufe der Zeit auf der Grundlage von ORF5-Sequenzen Abbildung 3 f) Stapelbarrendiagramm der relativen Frequenzen in China.

Diese Ergebnisse zeigen, daß L8 im letzten Jahrzehnt7.5 und L8.7.6 Stämme waren nicht nur die häufigsten, sondern auch die am weitesten verbreiteten in China.

# Beziehung zwischen HP-PRRSV MLVs und HP-PRRSVs
Um den Zusammenhang zwischen HP-PRRSV-abgeschwächten Impfstoffen (JXA1-R, HuN4-F112, TJM-F92, GDr180) und HP-PRRSV-ähnlichen Stämmen zu untersuchen, wurden in dieser Studie umfassend L8-Stämme analysiert.7.4 ¢8.7.7 Abstammungslinien basierend auf Nukleotididentität, NSP2-Deletionssignaturen und genomsweiten charakteristischen Aminosäurenveränderungen (Tabelle 1).

Tabelle 1 Genomweite Assoziationsanalyse zwischen HP-PRRSV-dämpften Impfstoffen (MLV) und HP-PRRSV-ähnlichen Stämmen

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Schlüssel zur Unterscheidung von Impfstoff-ähnlichem PRRSV von HP-PRRSV-ähnlichen Stämmen nicht durch die Nukleotid-Identität des gesamten Genoms oder durch charakteristische Aminosäurenveränderungen bestimmt werden kann.sondern durch das Vorhandensein zusätzlicher NSP2-Lösungen (Tabelle 1)Die statistische Analyse ergab, daß 27,85% (22/79) der L87.6 Stämme wurden mit dem Impfstoff in Verbindung gebracht.

Pathogenität von HP-PRRSV- und HP-PRRSV-ähnlichen Stämmen bei Ferkeln

# Isolierung und Identifizierung der dominanten HP-PRRSV-ähnlichen Stämme

Systematische Aufklärung der Pathogenität der dominanten HP-PRRSV-ähnlichen Stämme (L8.7.5 und L8.7.6), in dieser Studie wurde die L8 erfolgreich isoliert.7.5 Abstammungsstamm DLF und L8.7Diese Viren wurden aus Alveolare Makrophagen (PAM) und Marc-145-Zellen von Schweinen isoliert.Die IFA-Analyse ergab, dass die Expression des PRRSV-M-Proteins in PAMs und Marc-145-Zellen beobachtet wurde, die mit dem Stamm injiziert wurden (Abbildung 4 (a)), was anzeigt, dass die DLF- und DLW-Stämme erfolgreich getrennt wurden.

Abbildung 4 Isolierung, Kultivierung, Rekombinationsanalyse und charakteristische NSP2-Aminosäurenausrichtung des L8.7-Stamms

a) Identifizierung der DLW- und DLF-Stämme.Immunfluoreszenztest (IFA) mit einem monoklonalen Antikörper, der auf das PRRSV-M-Protein abzielt, ergab eine spezifische Reaktivität bei PAMs und Marc-145-Zellen aus der Kontrollgruppe., DLF-infizierte, DLW-infizierte und HuN4-infizierte Gruppen. Zellkernen wurden mit DAPI kontrastiert. Skala-Streifen = 300 μm. b) Analyse der Rekombinationsereignisse in DLW.c) Ausrichtung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der NSP2-Proteine der L8.7 Stämme.

# Genomische Merkmale von DLF und DLW

Die vollständigen Genomlängen von DLF (PQ178809) und DLW (PQ178810) sind 15,324 bzw. 15,323 Nukleotide (ohne den Poly(A-) Schwanz).HuN4/DLW und DLF/DLW waren 98.67%, 95,78% bzw. 95,13% (wie in der nachstehenden Tabelle dargestellt).

Die Sequenzbereinigung des NSP2-Proteins ergab, dass DLF und DLW in den Positionen 482 und 533-561 des NSP2-Proteins des CH-1a-Stammes diskontinuierliche Deletionen von 30 Aminosäuren (1 + 29 Aminosäuren) aufwiesen..Dieses Löschmuster entspricht dem von L8.7.3 (HP-PRRSV) (Abbildung 4 (c)). Um zu untersuchen, ob DLF und DLW an einem Rekombinationsereignis beteiligt waren,Eine Analyse mit SimPlot und RDP4-Software ergab, dass DLW ein Rekombinationsereignis erlebte (Rekombinationsstellen von nt 3500-5657), während DLW nicht (Abbildung 4 (b)). Basierend auf früheren Studien und den in dieser Studie verwendeten Kriterien zur Unterscheidung von Impfstoffstämmen von Wildtypstämmen waren sowohl DLF als auch DLW Wildtypstämme.

# Klinische Anzeichen von infizierten Ferkeln
Die Proben wurden alle sieben Tage gewogen und Blutproben an 0, 3, 5, 7, 10, 14 und 21 Tagen pro Jod entnommen.

Schweine in den HuN4- und DLF-Ausforderungsgruppen entwickelten beide offensichtliche klinische Symptome (Husten, Lethargie, Verdauungsstörungen und Schüttelfrost) 2 Tage nach der Exposition.Schweine in der Herausforderungsgruppe DLW zeigten 3 Tage nach der Exposition typische klinische Anzeichen einer PRRSV-Infektion.In der HuN4-Ausforderungsgruppe hatten die Ferkel ein hohes Fieber (≥ 40,0%).5°C) für 4­6 Tage (Abbildung 5b) und begann 12 Tage nach der Exposition zu sterben., mit einer Überlebensrate von 20% bis 21 Tage nach der Exposition (Abbildung 5 (c)).mit einer Überlebensrate von 60% bis 21 Tage nach der Exposition (Abbildung 5 (c))Trotz einer niedrigeren Sterblichkeitsrate war die Dauer des Fiebers in dieser Gruppe länger (7­15 Tage) (Abbildung 5b).mit einer kürzeren Dauer des Fiebers (1°8 Tage) (Abbildung 5 (b))Die Ferkel in der Kontrollgruppe zeigten keine offensichtlichen klinischen Symptome und überlebten während der gesamten Studie (Abbildung 5 (b, c)).

Abbildung 5b) Rektaltemperaturentwicklung nach der Prüfung mit DLF, DLW und HuN4.

Abbildung 5 (c) Überlebensraten nach der Herausforderung mit DLF, DLW und HuN4.

Das Gewicht der Ferkel wurde bei 0, 7, 14 und 21 dpi gemessen.Eine statistische Analyse ergab, dass die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme (ADG) von Ferkeln in der DLF-geprägten Gruppe signifikant niedriger war als bei nicht infizierten Ferkeln von 1 bis 7 dpi., 8 bis 14 dpi und 15 bis 21 dpi (Abbildung 5 (d)). Im Vergleich zu nicht infizierten Ferkeln war der ADG der Ferkel in der HuN4-geprägten Gruppe signifikant niedriger von 8 bis 14 dpi,Während die ADG der Ferkel in der DLW-geforderten Gruppe signifikant niedriger war, von 8 bis 14 dpi und von 15 bis 21 dpi (Abbildung 5 ((d)).

Abbildung 5 (d) Durchschnittliche Veränderungen der täglichen Gewichtszunahme in DLF-, DLW- und HuN4-Challenged-Gruppen

Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (Fehlerbalken) dargestellt. :p<0.05; :p<0.01; :p<0.001Die Kommission hat die Kommission aufgefordert,0001; ns: nicht statistisch signifikant.

# Dynamische Veränderungen bei PRRSV-spezifischen Antikörpern
Von allen Schweinen wurden Blutproben bei 0, 3, 5, 7, 10, 14 und 21 dpi entnommen und mit einem kommerziellen ELISA-Kit spezifische Antikörper gegen das PRRSV-N-Protein nachgewiesen.Die Ergebnisse zeigten, dass PRRSV-spezifische Antikörper (S/P-Verhältnis ≥ 0.4) wurden bei Schweine in den DLF- und HuN4-geprägten Gruppen bei 10 dpi nachgewiesen. Bei 14 dpi waren alle fünf Schweine in der DLW-geprägten Gruppe Antikörperpositiv (S/P-Verhältnis ≥ 0,4).Die S/P-Verhältnisse in den betroffenen Gruppen stiegen bis zum Ende des Experiments weiter an, während während des gesamten Versuchs keine PRRSV-spezifischen Antikörper in der unbefragten Gruppe nachgewiesen wurden (Abbildung 5 (e)).

# Beurteilung von Virämie und Viruslast in verschiedenen Geweben

Umgekehrte transkriptive quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) wurde verwendet, um die Verteilung der Viruslast in Serumproben und 10 Geweben zu analysieren, die bei der Autopsie bei 0, 3, 5, 7, 10, 14, 15 und 16 Jahren erhalten wurden.und 21 Tage nach der HerausforderungDie Ergebnisse zeigten, dass der Viremie-Spiegel in den betroffenen Gruppen 3 Tage nach der Herausforderung zu steigen begann.Spitzenwert 5 Tage nach der Herausforderung in den Gruppen DLF und DLW und 7 Tage nach der Herausforderung in der Gruppe HuN4 (Abbildung 5 (f))Die Virenbelastung ging dann allmählich zurück, und es wurden signifikante Unterschiede in den Virenwerten zwischen den betroffenen Gruppen 7 bis 10 Tage nach der Prüfung beobachtet (Abbildung 5 (f)).Virämie wurde in der Kontrollgruppe während der gesamten Herausforderungsperiode nicht nachgewiesen.Obwohl zwischen den betroffenen Gruppen Unterschiede in der Virenlast in denselben Geweben beobachtet wurden, waren diese Unterschiede nicht statistisch signifikant (Abbildung 5 (g)).Die ORF7-Gensequenzierung bestätigte, dass die Proben den ursprünglichen Herausforderungsstamm enthalten.

Abbildung 5 (f) Dynamische Veränderungen der Virämie durch DLF, DLW und HuN4

Abbildung 5 (g) Analyse der Viruslast in verschiedenen Geweben der Herausforderungsgruppen DLF, DLW und HuN4

# Grob- und Histopathologische Läsionen
Alle mit HuN4 infizierten Ferkel zeigten eine schwere Thymusatrophie (Abbildung 6 (a)).Es wurde keine Thymatrophie in der DLW-geprägten Gruppe beobachtet (Abbildung 6b)., c)).
Alle fünf Schweine in der Gruppe mit HuN4-Ausforderung zeigten eine Lungenkonsolidierung (Abbildung 6 (e)), von denen vier eine Hämorrhagie der Kiefer-Lymphknoten hatten (Abbildung 6 (m)).drei Patienten hatten eine Lungenkonsolidierung (Abbildung 6 (f)) und drei Patienten hatten eine Blutung der Kiefer-Lymphknoten (Abbildung 6 (n))Zwei der fünf Schweine in der DLW-geprägten Gruppe zeigten eine Lungenkonsolidierung (Abbildung 6 (g)) und zwei Schweine hatten eine leichte Blutung in den mandibulären Lymphknoten (Abbildung 6 (o)).Es wurden keine signifikanten pathologischen Veränderungen in den Organgeweben der nicht infizierten Ferkel beobachtet (Abbildung 6 (d))., h, p)).

Bei Schweinen, die mit HuN4 behandelt wurden, entwickelte sich eine schwere interstitielle Lungenentzündung mit Blutungen (Abbildung 6 (i)), die durch Verdickung der Alveolensekte und mononukleare Zellinfiltration gekennzeichnet ist.Mikroskopische Läsionen in den Lungen der DLF- und DLW-Gruppen waren ähnlich.Die DLF-geprüfte Gruppe zeigte eine umfangreiche Entzündungszellinfiltration mit serösen Exsudaten, Nekrose und Peeling der alveolären Epithelzellen,und signifikante Nekrose und Peeling von Bronchial-Epithelzellen (Abbildung 6 ((j))Die DLW-geprüfte Gruppe zeigte eine umfangreiche Entzündungszellinfiltration und eine moderate Vergrößerung der Alveolarsepte (Abbildung 6 (k)).Die betroffenen Gruppen zeigten unterschiedliche Grade von Medulärblutungen in den mandibularen Lymphknoten (Abbildung 6 ((q-t)), während bei den Kontrollschweinen keine pathologischen Läsionen in diesen Geweben beobachtet wurden (Abbildung 6 (i,t)).

Abbildung 6 Brutto- und histologische Lungenläsionen in verschiedenen Herausforderungsgruppen

Die mit HuN4 oder DLF untersuchten Ferkel zeigten unterschiedliche Grade der Thymatrophie (a, b).Die HuN4- und DLF-Infektionsgruppen entwickelten eine schwere interstitielle Lungenentzündung mit Lungenkonsolidierung (e, f) und Lymphknotenblutungen (i, j), während die DLW-Infektionsgruppe eine mildere interstitielle Lungenentzündung mit Lungenkonsolidierung (g) und Lymphknotenblutungen (o) aufwies.Lungengewebe der betroffenen Gruppen zeigten unterschiedliche Grade interstitieller Lungenentzündung., gekennzeichnet durch umfangreiche Entzündungszellinfiltration, alveolare Epithelhyperplasie und Erweiterung der alveolare Septa (i-k).In den betroffenen Gruppen wurden in den mandibularen Lymphknoten medulläre Blutungen beobachtet (q-t), jedoch nicht in der Kontrollgruppe (r).

Schlussfolgerung

Die L8.7-Linie ist die früheste PRRSV-Linie, die in China entdeckt wurde und seit über 25 Jahren im Umlauf ist.hat in China eine Epidemie mit hohem Fieber verursachtDer neue Stamm verbreitete sich in China und Asien und erlebte eine bedeutende Mutation.HP-PRRSV und seine Varianten sind in China zu den dominierenden Stämmen geworden, aber die Forschung zu den epidemiologischen Mustern, der molekularen Evolution und der Pathogenität des neuartigen L8.7 PRRSV bleibt unterentwickelt.7 PRRSV und führte eine umfassende und systematische Analyse.

Der Schwerpunkt der L8.7-Stämme lag in erster Linie auf ihrer Pathogenität, insbesondere seit dem Ausbruch des L8-Virus im Jahr 2006.7.3 Stamm (HP-PRRSV). Daher wurde in dieser Studie die Pathogenität der dominantesten HP-PRRSV-ähnlichen Stämme (L8.7.5: DLF; L8.7.6Die Ergebnisse zeigten, dass, obwohl die Virulenz von HP-PRRSV-ähnlichen Stämmen (DLF und DLW) im Vergleich zu HP-PRRSV (HuN4) reduziert war (wie durch eine erhöhte Überlebensrate von Ferkeln belegt), die Virulenz vonerhöhte Tagesgewichtszunahme, verringerte Fiebertemperatur und -dauer und Unterschiede in der Thymatrophie) zeigten sie immer noch eine signifikante Pathogenität.Die Virulenz in dieser Studie korrelierte mit der Serumvirenlast bei herausgeforderten Ferkeln 7 und 10 Tage nach der Impfung.Die Überlebensrate, die Fiebertemperatur und -dauer, dieund Thymatrophie sind wichtige Indikatoren für die Pathogenität von PRRSV bei Ferkeln.