новости компании о Последние исследования. Эволюция генетики и патогенности высокопатогенного репродуктивного и дыхательного заболевания свиней.

В 2006 году HP-PRRSV, произошедший от классического PRRSV, вызвал эпидемию в Китае, характеризующуюся высокой температурой, заболеваемостью и смертностью. Впоследствии штамм широко распространился по всему Китаю и Азии, претерпев значительные мутации. HP-PRRSV и его варианты стали доминирующими штаммами в Китае, но исследования эпидемиологических закономерностей, молекулярной эволюции и патогенности нового PRRSV L8.7 остаются ограниченными.

22 мая 2025 года в журнале Taylor & Francis было опубликовано исследование под названием «Генетическая эволюция и патогенная изменчивость высокопатогенного вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней», в котором систематически объяснялась динамика эпидемии, эволюционные тенденции, ассоциации вакцинных штаммов и законы эволюции патогенности линии L8.7.

Это исследование предоставляет ключевую поддержку данными для разработки стратегий профилактики и борьбы с L8.7 PRRSV.

Аннотация

На основе анализа 2509 глобальных последовательностей гена ORF5 L8.7 линия L8.7 была разделена на семь групп (L8.7.1-L8.7.7). L8.7.1-L8.7.3 соответствуют зарегистрированным классическим PRRSV, промежуточным штаммам и HP-PRRSV соответственно, в то время как L8.7.4-L8.7.7 определяются как HP-подобные PRRSV.

Статистический анализ показал, что HP-подобные PRRSV преобладали в пределах линии L8.7, при этом штаммы L8.7.5 и L8.7.6 представляли наибольшую долю в последние годы. Всесторонний анализ всего генома показал, что 72,15% штаммов L8.7 демонстрировали характеристики дикого типа.
Анализ скорости эволюции показал, что скорость эволюции линий L8.7.3-L8.7.7 в Китае снизилась примерно в 4,1 раза с момента внедрения аттенуированной вакцины HP-PRRSV (MLV).

Тестирование патогенности показало, что по сравнению с HP-PRRSV (L8.7.3: HuN4), HP-PRRSV-подобные штаммы (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) сохраняют высокую вирулентность, демонстрируя при этом сниженную патогенность у поросят.

# Графический абстракт

Экспериментальные результаты

# Классификация L8.7 PRRSV

Для анализа эволюционных характеристик PRRSV L8.7 в этом исследовании было проанализировано в общей сложности 2509 последовательностей ORF5: 2159 последовательностей штаммов L8.7 были получены из базы данных NCBI, а 350 последовательностей были собраны в нашей лаборатории в период с 2014 по 2023 год (рисунок 1(a)). Как показано на рисунке, штаммы L8.7 были дополнительно разделены на семь групп (L8.7.1–8.7.7) (рисунки 1(a, b)); вся информация о последовательностях доступна (рисунок 2).

Как показано на рисунке 1(b), референсные штаммы, использованные для построения филогенетического дерева, были из известных классических штаммов и штаммов PRRSV L8.7, о которых сообщалось в исследованиях патогенности. Средние генетические расстояния внутри и между группами показаны на рисунке 1(c). За исключением L8.7.2, средние генетические расстояния внутри всех групп были менее 5%. В целом, генетические расстояния между группами варьировались от 4,3% до 10,4%. Кроме того, штаммы L8.7.4-L.7.7 демонстрировали специфические паттерны мутаций аминокислот с различными характеристиками и были определены как HP-PRRSV-подобные. Среди 2509 последовательностей в популяции L8.7 2,23% (56/2509) принадлежали L8.7.1 (CH-1a-подобный PRRSV), 4,74% (119/2509) - L8.7.2 (промежуточный PRRSV), 11,48% (288/2509) - L8.7.3 (HP-PRRSV) и 81,54% (2046/2509) - HP-PRRSV-подобные.

Рисунок 1 Филогенетическое дерево и анализ идентичности нуклеотидов штаммов L8.7

(a) Филогенетическое дерево, разделяющее последовательности L8.7 на семь групп. (b) Филогенетическое дерево, построенное на основе гена ORF5 изолятов PRRSV L8.7 и референсных штаммов PRRSV из каждой линии. Экспериментальные штаммы, использованные в этом исследовании, отмечены желтыми звездами. (c) Генетические расстояния внутри и между группами штаммов L8.7 (процент различий в нуклеотидах).

Рисунок 2 Сравнительный анализ патогенности PRRSV L8.7.1-L8.7.7

# Глобальное распространение PRRSV L8.7

В этом исследовании был проведен всесторонний анализ последовательностей L8.7, для которых известна временная и географическая информация. Примечательно, что группа L8.7.4 была наиболее распространенной, охватывая восемь из девяти стран, где были обнаружены штаммы L8.7 (рисунок 3(a, b)). В Непале, Лаосе и Мьянме была обнаружена только одна группа, L8.7.4; другие группы не были обнаружены. Штаммы L8.7.1, 8.7.3, 8.7.5, 8.7.6 и 8.7.7 были обнаружены в двух, трех, четырех, четырех и двух странах соответственно (рисунок 3(a, b)). Штамм L8.7.2 был зарегистрирован только в Китае (рисунок 3(b)). Количество (2201/2509, 87,7%) и разнообразие (7/7 групп, 100%) штаммов PRRSV L8.7 в Китае занимают первое место (рисунок 3(b)).

Рисунок 3 (a) Географическое распределение штаммов L8.7 в разных регионах мира. Рисунок 3 (b) Национальное распределение штаммов L8.7.

В этом исследовании было проанализировано в общей сложности 2201 штамм PRRSV L8.7 из Китая. Сообщалось об инфекции L8.7 PRRSV в 26 провинциях Китая, при этом в провинции Гуандун было зарегистрировано наибольшее количество случаев, за ней следуют Гуанси, Хэйлунцзян, Шаньдун, Хэбэй и Хэнань, в каждой из которых было зарегистрировано более 40 случаев (рисунок 3 (c, d)). Распространенность различных групп PRRSV в Китае демонстрирует временную динамику (рисунок 3 (e)), с четкими пиками распространенности в определенных группах. Группы L8.7.1 и L8.7.2 были обнаружены в очень низких количествах и редко регистрировались с 2006 года. Группа L8.7.3, после вспышки в 2006 году, стала доминирующей и сохранялась с 2006 по 2009 год.

Рисунок 3(c) Географическое распределение штаммов L8.7 в разных регионах Китая. Рисунок 3(d) Распределение популяции штаммов L8.7 в различных провинциях Китая.

HP-подобные PRRSV (L8.7.4-8.7.7) постепенно заменили HP-PRRSV в качестве преобладающих циркулирующих штаммов в Китае (рисунок 3(e)). Группа L8.7.4 была впервые зарегистрирована и отслеживалась в Китае в 2006 году и составляла значительную долю штаммов L8.7 в Китае в период с 2009 по 2011 год (41,3%-79,6%). Примечательно, что некоторые группы испытали внезапное увеличение распространенности: например, группа L8.7.5, которая впервые появилась в Китае в 2007 году и постоянно циркулирует, наблюдала значительное увеличение распространенности с 2011 года (17,1%-51,6%) (рисунок 3(f)). Циклический характер штамма L8.7.6 также заслуживает внимания. Эта группа (EU709835.1, SH02) была впервые идентифицирована в 2002 году. Первоначально частота ее обнаружения была чрезвычайно низкой (только один штамм), и она не была обнаружена в период с 2003 по 2005 год. После быстрого увеличения в 2006 году ее распространенность постепенно снижалась до 2009 года. Затем она стала преобладающим штаммом в период с 2014 по 2023 год, составляя от 21,5% до 47,1%. Группа L8.7.6 чаще всего обнаруживалась в Китае (612/2201, 27,8%) и имела самое широкое распространение (20/21 провинций, 95,2%) (рисунок 3(d, f)). Группа L8.7.7 была впервые обнаружена в 2008 году, но ее распространенность оставалась низкой до 2011 года, после чего она постепенно увеличивалась. Частота ее обнаружения быстро увеличилась до 15,1% - 17,1% в период с 2022 по 2023 год.

Рисунок 3 (e) Распределение штаммов L8.7 с течением времени на основе последовательностей ORF5. Рисунок 3 (f) Столбчатая диаграмма относительных частот по всему Китаю.

Эти результаты показывают, что за последнее десятилетие штаммы L8.7.5 и L8.7.6 были не только самыми многочисленными, но и наиболее широко распространенными в Китае.

# Взаимосвязь между HP-PRRSV MLV и HP-PRRSV
Чтобы исследовать связь между аттенуированными вакцинами HP-PRRSV (JXA1-R, HuN4-F112, TJM-F92, GDr180) и HP-PRRSV-подобными штаммами, в этом исследовании был проведен всесторонний анализ штаммов линий L8.7.4–8.7.7 на основе идентичности нуклеотидов, сигнатур делеций NSP2 и характерных изменений аминокислот во всем геноме (таблица 1).

Таблица 1 Анализ ассоциации всего генома между аттенуированной вакциной HP-PRRSV (MLV) и HP-PRRSV-подобными штаммами

Результаты показывают, что ключ к различению вакциноподобных PRRSV от HP-PRRSV-подобных штаммов нельзя определить по идентичности нуклеотидов всего генома или характерным изменениям аминокислот, а скорее по наличию дополнительных делеций NSP2 (таблица 1). Статистический анализ показал, что 27,85% (22/79) штаммов линии L8.7.6 были связаны с вакциной.

Патогенность HP-PRRSV и HP-PRRSV-подобных штаммов у поросят

# Выделение и идентификация доминирующих HP-PRRSV-подобных штаммов

Чтобы систематически выяснить патогенность доминирующих HP-PRRSV-подобных штаммов (L8.7.5 и L8.7.6), в этом исследовании был успешно выделен штамм линии L8.7.5 DLF и штамм линии L8.7.6 DLW. Эти вирусы были выделены из альвеолярных макрофагов свиней (PAM) и клеток Marc-145. Анализ IFA показал, что экспрессия белка M PRRSV наблюдалась в PAM и клетках Marc-145, инокулированных штаммом (рисунок 4(a)), что указывает на успешное разделение штаммов DLF и DLW.

Рисунок 4 Выделение, культивирование, анализ рекомбинации и характеристическое выравнивание аминокислот NSP2 штамма L8.7

(a) Идентификация штаммов DLW и DLF. Иммунофлуоресцентный анализ (IFA) с использованием моноклонального антитела, нацеленного на белок M PRRSV, выявил специфическую реактивность в PAM и клетках Marc-145 из контрольной группы, групп, инфицированных DLF, DLW и HuN4. Клеточные ядра были окрашены DAPI. Масштабная линейка = 300 мкм. (b) Анализ событий рекомбинации в DLW. (c) Выравнивание выведенных аминокислотных последовательностей белков NSP2 штаммов L8.7.

# Геномные характеристики DLF и DLW

Полная длина генома DLF (PQ178809) и DLW (PQ178810) составляет 15 324 и 15 323 нуклеотида соответственно (исключая поли(A)-хвост). Геномное сходство нуклеотидов между HuN4/DLF, HuN4/DLW и DLF/DLW составило 98,67%, 95,78% и 95,13% соответственно (как показано в таблице ниже).

Выравнивание последовательности белка NSP2 показало, что DLF и DLW демонстрировали прерывистые делеции из 30 аминокислот (1 + 29 аминокислот) в положениях 482 и 533-561 в белке NSP2 штамма CH-1a. Этот паттерн делеции соответствует таковому у L8.7.3 (HP-PRRSV) (рисунок 4(c)). Чтобы исследовать, были ли DLF и DLW вовлечены в событие рекомбинации, анализ с использованием программ SimPlot и RDP4 показал, что DLW претерпел событие рекомбинации (сайты рекомбинации охватывают nt 3500-5657), в то время как DLW - нет (рисунок 4(b)). Основываясь как на предыдущих исследованиях, так и на критериях, используемых в этом исследовании для различения вакцинных штаммов и штаммов дикого типа, как DLF, так и DLW были штаммами дикого типа.

# Клинические признаки инфицированных поросят
Поросят, подвергшихся воздействию, взвешивали каждые 7 дней, а образцы крови собирали на 0, 3, 5, 7, 10, 14 и 21 день после периода. Экспериментальная процедура показана на рисунке 5(a).

У поросят в группах, подвергшихся воздействию HuN4 и DLF, к 2 дням после воздействия развились очевидные клинические симптомы (кашель, вялость, расстройство пищеварения и озноб). Поросята в группе, подвергшейся воздействию DLW, проявили типичные клинические признаки инфекции PRRSV к 3 дням после воздействия, при этом у 3 из 5 инфицированных свиней наблюдались кашель, вялость, расстройство пищеварения и дрожь. Поросята в группе, подвергшейся воздействию HuN4, поддерживали высокую температуру (≥40,5°C) в течение 4–6 дней (рисунок 5(b)) и начали умирать к 12 дням после воздействия, при этом выживаемость составила 20% к 21 дню после воздействия (рисунок 5(c)). Поросята в группе, подвергшейся воздействию DLF, начали умирать к 16 дням после воздействия, при этом выживаемость составила 60% к 21 дню после воздействия (рисунок 5(c)). Несмотря на более низкий уровень смертности, продолжительность лихорадки в этой группе была дольше (7–15 дней) (рисунок 5(b)). Поросята в группе, подвергшейся воздействию DLW, выжили до конца эксперимента, с более короткой продолжительностью лихорадки (1–8 дней) (рисунок 5(b)). Поросята в контрольной группе не проявили каких-либо очевидных клинических симптомов и выжили на протяжении всего исследования (рисунок 5(b, c)).

Рисунок 5(b) Тенденции ректальной температуры после воздействия DLF, DLW и HuN4.

Рисунок 5(c) Выживаемость после воздействия DLF, DLW и HuN4.

Вес поросят измеряли на 0, 7, 14 и 21 день после заражения. Статистический анализ показал, что средняя ежедневная прибавка в весе (ADG) поросят в группе, подвергшейся воздействию DLF, была значительно ниже, чем у неинфицированных поросят с 1 по 7 день после заражения, с 8 по 14 день после заражения и с 15 по 21 день после заражения (рисунок 5(d)). По сравнению с неинфицированными поросятами, ADG поросят в группе, подвергшейся воздействию HuN4, была значительно ниже с 8 по 14 день после заражения, в то время как ADG поросят в группе, подвергшейся воздействию DLW, была значительно ниже с 8 по 14 день после заражения и с 15 по 21 день после заражения (рисунок 5(d)).

Рисунок 5(d) Изменения средней ежедневной прибавки в весе в группах, подвергшихся воздействию DLF, DLW и HuN4

Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (полосы погрешностей). :p<0,05; :p<0,01; :p<0,001; ****:p<0,0001; ns: статистически незначимо.

# Динамические изменения PRRSV-специфических антител
Образцы крови были взяты у всех свиней на 0, 3, 5, 7, 10, 14 и 21 день после заражения, и антитела, специфичные к белку N PRRSV, были обнаружены с использованием коммерческого набора ELISA. Результаты показали, что PRRSV-специфические антитела (соотношение S/P ≥ 0,4) были обнаружены у поросят в группах, подвергшихся воздействию DLF и HuN4, на 10 день после заражения. К 14 дню после заражения все пять поросят в группе, подвергшейся воздействию DLW, были положительными по антителам (соотношение S/P ≥ 0,4). Соотношения S/P в подвергшихся воздействию группах продолжали увеличиваться до конца эксперимента, в то время как PRRSV-специфические антитела не были обнаружены в группе, не подвергшейся воздействию, на протяжении всего эксперимента (рисунок 5(e)).

# Оценка виремии и вирусной нагрузки в различных тканях

Обратная транскрипция-количественная полимеразная цепная реакция (ОТ-кПЦР) была использована для анализа распределения вирусной нагрузки в образцах сыворотки и 10 тканях, полученных при вскрытии на 0, 3, 5, 7, 10, 14 и 21 день после заражения. Результаты показали, что уровни виремии в подвергшихся воздействию группах начали увеличиваться на 3 день после заражения, достигнув пика на 5 день после заражения в группах DLF и DLW и на 7 день после заражения в группе HuN4 (рисунок 5(f)). Затем вирусная нагрузка постепенно снижалась. Значительные различия в уровнях виремии наблюдались между подвергшимися воздействию группами с 7 по 10 день после заражения (рисунок 5(f)). Виремия не была обнаружена в контрольной группе на протяжении всего периода заражения. Хотя различия в вирусной нагрузке в одних и тех же тканях наблюдались между подвергшимися воздействию группами, эти различия не были статистически значимыми (рисунок 5(g)). Секвенирование гена ORF7 подтвердило, что образцы содержали исходный штамм заражения.

Рисунок 5(f) Динамические изменения виремии, вызванной воздействием DLF, DLW и HuN4

Рисунок 5(g) Анализ вирусной нагрузки в различных тканях групп, подвергшихся воздействию DLF, DLW и HuN4

# Грубые и гистопатологические поражения
У всех инфицированных HuN4 поросят наблюдалась тяжелая атрофия тимуса (рисунок 6(a)). У четырех поросят в группе, подвергшейся воздействию DLF, наблюдалась значительная атрофия тимуса, в то время как атрофия тимуса не наблюдалась в группе, подвергшейся воздействию DLW (рисунки 6(b, c)).
У всех пяти свиней в группе, подвергшейся воздействию HuN4, наблюдалась консолидация легких (рисунок 6(e)), из которых у четырех было кровоизлияние в нижнечелюстные лимфатические узлы (рисунок 6(m)). Из пяти свиней в группе, подвергшейся воздействию DLF, у трех наблюдалась консолидация легких (рисунок 6(f)) и у трех было кровоизлияние в нижнечелюстные лимфатические узлы (рисунок 6(n)). У двух из пяти свиней в группе, подвергшейся воздействию DLW, наблюдалась консолидация легких (рисунок 6(g)), и у двух свиней было легкое кровоизлияние в нижнечелюстные лимфатические узлы (рисунок 6(o)). Никаких существенных патологических изменений в тканях органов не наблюдалось у неинфицированных поросят (рисунок 6(d, h, p)).

У свиней, подвергшихся воздействию HuN4, развилась тяжелая интерстициальная пневмония с кровоизлиянием (рисунок 6(i)), характеризующаяся утолщением альвеолярных перегородок и инфильтрацией мононуклеарных клеток. Микроскопические поражения в легких групп, подвергшихся воздействию DLF и DLW, были аналогичными, но различались по степени тяжести (рисунок 6(j, k)). Группа, подвергшаяся воздействию DLF, показала обширную инфильтрацию воспалительных клеток с серозными экссудатами, некрозом и отслоением альвеолярных эпителиальных клеток, а также значительным некрозом и отслоением эпителиальных клеток бронхов (рисунок 6(j)). Группа, подвергшаяся воздействию DLW, показала обширную инфильтрацию воспалительных клеток и умеренное расширение альвеолярных перегородок (рисунок 6(k)). Кроме того, по сравнению с контрольной группой, подвергшиеся воздействию группы показали различную степень кровоизлияния в мозговое вещество в нижнечелюстных лимфатических узлах (рисунок 6(q-t)), в то время как никаких патологических поражений в этих тканях у контрольных свиней не наблюдалось (рисунок 6(i, t)).

Рисунок 6 Грубые и гистологические поражения легких в различных группах воздействия

У поросят, подвергшихся воздействию HuN4 или DLF, наблюдалась различная степень атрофии тимуса (a, b). По сравнению с контрольной группой, группы инфекции HuN4 и DLF развили тяжелую интерстициальную пневмонию с консолидацией легких (e, f) и кровоизлиянием в лимфатические узлы (i, j), в то время как группа инфекции DLW продемонстрировала более легкую интерстициальную пневмонию с консолидацией легких (g) и кровоизлиянием в лимфатические узлы (o). Ткани легких из подвергшихся воздействию групп демонстрировали различную степень интерстициальной пневмонии, характеризующуюся обширной инфильтрацией воспалительных клеток, гиперплазией альвеолярного эпителия и расширением альвеолярных перегородок (i-k). Кроме того, в нижнечелюстных лимфатических узлах подвергшихся воздействию групп наблюдались кровоизлияния в мозговое вещество (q-t), но не в контрольной группе (r).

Заключение

Линия L8.7 является самой ранней линией PRRSV, обнаруженной в Китае, и циркулирует уже более 25 лет. В 2006 году HP-PRRSV, штамм, полученный из классического PRRSV, вызвал эпидемию в Китае, характеризующуюся высокой температурой, заболеваемостью и смертностью. Впоследствии этот штамм широко распространился по всему Китаю и Азии, претерпев значительные мутации. Примечательно, что HP-PRRSV и его варианты стали доминирующими штаммами в Китае, но исследования эпидемиологических закономерностей, молекулярной эволюции и патогенности нового PRRSV L8.7 остаются недостаточно развитыми. Поэтому это исследование было сосредоточено на PRRSV L8.7 и провело всесторонний и систематический анализ.

Основное внимание штаммов L8.7 уделялось в первую очередь их патогенности, особенно после вспышки 2006 года, вызванной штаммом L8.7.3 (HP-PRRSV). Поэтому в этом исследовании была выделена и оценена патогенность наиболее доминирующих HP-PRRSV-подобных штаммов (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) в пределах линии L8.7. Результаты показали, что, хотя вирулентность HP-PRRSV-подобных штаммов (DLF и DLW) была снижена по сравнению с HP-PRRSV (HuN4) (о чем свидетельствует увеличение выживаемости поросят, увеличение ежедневной прибавки в весе, снижение температуры и продолжительности лихорадки, а также различия в атрофии тимуса), они все еще проявляли значительную патогенность. Вирулентность в этом исследовании коррелировала с вирусной нагрузкой в сыворотке крови у поросят, подвергшихся воздействию, на 7 и 10 день после инокуляции, в то время как значительных различий в другие моменты времени не наблюдалось. Поэтому выживаемость, температура и продолжительность лихорадки, а также атрофия тимуса являются важными показателями патогенности PRRSV у поросят.