Nel 2006, l'HP-PRRSV, evolutosi dal PRRSV classico, ha causato un'epidemia in Cina caratterizzata da febbre alta, morbilità e mortalità. Successivamente, il ceppo si è diffuso ampiamente in tutta la Cina e in Asia, subendo significative mutazioni. L'HP-PRRSV e le sue varianti sono diventati i ceppi dominanti in Cina, ma la ricerca sui modelli epidemiologici, l'evoluzione molecolare e la patogenicità del nuovo PRRSV L8.7 rimane limitata.
Il 22 maggio 2025, uno studio intitolato "Evoluzione genetica e variazione patogena del virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina altamente patogena" pubblicato sulla rivista Taylor & Francis ha spiegato sistematicamente le dinamiche epidemiche, le tendenze evolutive, le associazioni con i ceppi vaccinali e le leggi sull'evoluzione della patogenicità del lignaggio L8.7.
Questo studio fornisce un supporto di dati chiave per lo sviluppo di strategie di prevenzione e controllo del PRRSV L8.7.
Abstract
Sulla base dell'analisi di 2.509 sequenze globali del gene ORF5 di L8.7, il lignaggio L8.7 è stato diviso in sette gruppi (L8.7.1-L8.7.7). L8.7.1-L8.7.3 corrispondono rispettivamente al PRRSV classico segnalato, ai ceppi intermedi e all'HP-PRRSV, mentre L8.7.4-L8.7.7 sono definiti come PRRSV simili all'HP.
L'analisi statistica ha mostrato che i PRRSV simili all'HP hanno predominato all'interno del lignaggio L8.7, con i ceppi L8.7.5 e L8.7.6 che rappresentano la proporzione più alta negli ultimi anni. Un'analisi completa dell'intero genoma ha rivelato che il 72,15% dei ceppi L8.7 ha mostrato caratteristiche di tipo selvatico.
L'analisi del tasso evolutivo ha rivelato che il tasso evolutivo dei lignaggi L8.7.3-L8.7.7 in Cina è diminuito di circa 4,1 volte dall'introduzione del vaccino HP-PRRSV attenuato (MLV).
I test di patogenicità hanno rivelato che, rispetto all'HP-PRRSV (L8.7.3: HuN4), i ceppi simili all'HP-PRRSV (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) mantengono un'elevata virulenza pur mostrando una ridotta patogenicità nei suinetti.
# Abstract grafico
Risultati sperimentali
# Classificazione del PRRSV L8.7
Per analizzare le caratteristiche evolutive del PRRSV L8.7, questo studio ha analizzato un totale di 2509 sequenze ORF5: 2159 sequenze di ceppi L8.7 sono state ottenute dal database NCBI e 350 sequenze sono state raccolte nel nostro laboratorio tra il 2014 e il 2023 (Figura 1(a)). Come mostrato nella figura, i ceppi L8.7 sono stati ulteriormente suddivisi in sette gruppi (L8.7.1–8.7.7) (Figure 1(a, b)); tutte le informazioni sulla sequenza sono disponibili (Figura 2).
Come mostrato nella Figura 1(b), i ceppi di riferimento utilizzati per costruire l'albero filogenetico provenivano da ceppi classici noti e ceppi PRRSV L8.7 segnalati negli studi sulla patogenicità. Le distanze genetiche medie all'interno e tra i gruppi sono mostrate nella Figura 1(c). Con l'eccezione di L8.7.2, le distanze genetiche medie all'interno di tutti i gruppi erano inferiori al 5%. Complessivamente, le distanze genetiche tra i gruppi variavano dal 4,3% al 10,4%. Inoltre, i ceppi L8.7.4-L.7.7 hanno mostrato specifici modelli di mutazione degli amminoacidi con caratteristiche diverse e sono stati definiti come simili all'HP-PRRSV. Tra le 2509 sequenze nella popolazione L8.7, il 2,23% (56/2509) apparteneva a L8.7.1 (PRRSV simile a CH-1a), il 4,74% (119/2509) a L8.7.2 (PRRSV intermedio), l'11,48% (288/2509) a L8.7.3 (HP-PRRSV) e l'81,54% (2046/2509) a simili all'HP-PRRSV.
Figura 1 Albero filogenetico e analisi dell'identità nucleotidica dei ceppi L8.7
(a) Albero filogenetico che divide le sequenze L8.7 in sette gruppi. (b) Albero filogenetico costruito sulla base del gene ORF5 degli isolati PRRSV L8.7 e dei ceppi PRRSV di riferimento di ogni lignaggio. I ceppi sperimentali utilizzati in questo studio sono contrassegnati con stelle gialle. (c) Distanze genetiche all'interno e tra i gruppi di ceppi L8.7 (percentuale di differenze nucleotidiche).
Figura 2 Analisi comparativa della patogenicità di PRRSV L8.7.1-L8.7.7
# Distribuzione globale di PRRSV L8.7
Questo studio ha analizzato in modo completo le sequenze L8.7 per le quali sono note informazioni temporali e geografiche. In particolare, il gruppo L8.7.4 era il più diffuso, coprendo otto dei nove paesi in cui sono stati trovati ceppi L8.7 (Figura 3(a, b)). Nepal, Laos e Myanmar hanno rilevato un solo gruppo, L8.7.4; non sono stati trovati altri gruppi. I ceppi L8.7.1, 8.7.3, 8.7.5, 8.7.6 e 8.7.7 sono stati trovati rispettivamente in due, tre, quattro, quattro e due paesi (Figura 3(a, b)). Il ceppo L8.7.2 è stato segnalato solo in Cina (Figura 3(b)). Il numero (2201/2509, 87,7%) e la diversità (7/7 gruppi, 100%) dei ceppi PRRSV L8.7 in Cina si sono classificati al primo posto (Figura 3(b)).
Figura 3 (a) Distribuzione geografica dei ceppi L8.7 in diverse regioni del mondo. Figura 3 (b) Distribuzione nazionale dei ceppi L8.7.
Questo studio ha analizzato un totale di 2.201 ceppi PRRSV L8.7 provenienti dalla Cina. L'infezione da PRRSV L8.7 è stata segnalata in 26 province in Cina, con la provincia di Guangdong che ha segnalato il maggior numero di casi, seguita da Guangxi, Heilongjiang, Shandong, Hebei e Henan, ognuna con oltre 40 casi segnalati (Figura 3 (c, d)). La prevalenza dei diversi gruppi PRRSV in Cina mostra dinamiche temporali (Figura 3 (e)), con picchi distinti di prevalenza in gruppi specifici. I gruppi L8.7.1 e L8.7.2 sono stati rilevati a tassi molto bassi e sono stati raramente segnalati dal 2006. Il gruppo L8.7.3, dopo aver causato un'epidemia nel 2006, è diventato dominante e persistente dal 2006 al 2009.
Figura 3(c) Distribuzione geografica dei ceppi L8.7 in diverse regioni della Cina. Figura 3(d) Distribuzione della popolazione dei ceppi L8.7 in varie province della Cina.
I PRRSV simili all'HP (L8.7.4-8.7.7) hanno gradualmente sostituito l'HP-PRRSV come ceppi circolanti predominanti in Cina (Figura 3(e)). Il gruppo L8.7.4 è stato segnalato e monitorato per la prima volta in Cina nel 2006 e ha rappresentato una proporzione significativa dei ceppi L8.7 in Cina tra il 2009 e il 2011 (41,3%-79,6%). In particolare, alcuni gruppi hanno subito improvvisi aumenti di prevalenza: ad esempio, il gruppo L8.7.5, apparso per la prima volta in Cina nel 2007 e in circolazione continua, ha visto un aumento significativo della prevalenza dal 2011 (17,1%-51,6%) (Figura 3(f)). È degna di nota anche la natura ciclica del ceppo L8.7.6. Questo gruppo (EU709835.1, SH02) è stato identificato per la prima volta nel 2002. Inizialmente, il suo tasso di rilevamento era estremamente basso (un solo ceppo) e non è stato rilevato tra il 2003 e il 2005. Dopo un rapido aumento nel 2006, la sua prevalenza è gradualmente diminuita fino al 2009. È poi diventato il ceppo predominante tra il 2014 e il 2023, rappresentando dal 21,5% al 47,1%. Il gruppo L8.7.6 è stato rilevato più frequentemente in Cina (612/2201, 27,8%) e ha avuto la distribuzione più ampia (20/21 province, 95,2%) (Figura 3(d, f)). Il gruppo L8.7.7 è stato rilevato per la prima volta nel 2008, ma la sua prevalenza è rimasta bassa fino al 2011, dopodiché è gradualmente aumentata. Il suo tasso di rilevamento è aumentato rapidamente dal 15,1% al 17,1% tra il 2022 e il 2023.
Figura 3 (e) Distribuzione dei ceppi L8.7 nel tempo in base alle sequenze ORF5. Figura 3 (f) Grafico a barre impilate delle frequenze relative in tutta la Cina.
Questi risultati rivelano che nell'ultimo decennio, i ceppi L8.7.5 e L8.7.6 non solo sono stati i più abbondanti, ma anche i più ampiamente distribuiti in Cina.
# Relazione tra MLV HP-PRRSV e HP-PRRSV
Per indagare l'associazione tra i vaccini attenuati HP-PRRSV (JXA1-R, HuN4-F112, TJM-F92, GDr180) e i ceppi simili all'HP-PRRSV, questo studio ha analizzato in modo completo i ceppi dei lignaggi L8.7.4–8.7.7 sulla base dell'identità nucleotidica, delle firme di delezione NSP2 e delle modifiche degli amminoacidi caratteristiche dell'intero genoma (Tabella 1).
Tabella 1 Analisi di associazione dell'intero genoma tra il vaccino attenuato HP-PRRSV (MLV) e i ceppi simili all'HP-PRRSV
I risultati indicano che la chiave per distinguere il PRRSV simile al vaccino dai ceppi simili all'HP-PRRSV non può essere determinata dall'identità nucleotidica dell'intero genoma o dalle modifiche degli amminoacidi caratteristici, ma piuttosto dalla presenza di ulteriori delezioni NSP2 (Tabella 1). L'analisi statistica ha rivelato che il 27,85% (22/79) dei ceppi del lignaggio L8.7.6 era associato al vaccino.
Patogenicità dei ceppi HP-PRRSV e simili all'HP-PRRSV nei suinetti
# Isolamento e identificazione dei ceppi dominanti simili all'HP-PRRSV
Per chiarire sistematicamente la patogenicità dei ceppi dominanti simili all'HP-PRRSV (L8.7.5 e L8.7.6), questo studio ha isolato con successo il ceppo del lignaggio L8.7.5 DLF e il ceppo del lignaggio L8.7.6 DLW. Questi virus sono stati isolati da macrofagi alveolari suini (PAM) e cellule Marc-145. Il test IFA ha mostrato che l'espressione della proteina M del PRRSV è stata osservata nei PAM e nelle cellule Marc-145 inoculate con il ceppo (Figura 4(a)), indicando che i ceppi DLF e DLW sono stati separati con successo.
Figura 4 Isolamento, coltura, analisi della ricombinazione e allineamento degli amminoacidi NSP2 caratteristici del ceppo L8.7
(a) Identificazione dei ceppi DLW e DLF. Il test di immunofluorescenza (IFA) utilizzando un anticorpo monoclonale diretto contro la proteina M del PRRSV ha rivelato una reattività specifica nei PAM e nelle cellule Marc-145 dei gruppi di controllo, infettati da DLF, infettati da DLW e infettati da HuN4. I nuclei cellulari sono stati controcolorati con DAPI. Barra della scala = 300 μm. (b) Analisi degli eventi di ricombinazione in DLW. (c) Allineamento delle sequenze amminoacidiche dedotte delle proteine NSP2 dei ceppi L8.7.
# Caratteristiche genomiche di DLF e DLW
Le lunghezze complete del genoma di DLF (PQ178809) e DLW (PQ178810) sono rispettivamente 15.324 e 15.323 nucleotidi (esclusa la coda poli(A)). Le somiglianze nucleotidiche genomiche tra HuN4/DLF, HuN4/DLW e DLF/DLW erano rispettivamente 98,67%, 95,78% e 95,13% (come mostrato nella tabella sottostante).
L'allineamento della sequenza della proteina NSP2 ha rivelato che DLF e DLW hanno mostrato delezioni discontinue di 30 amminoacidi (1 + 29 amminoacidi) in posizione 482 e 533-561 nella proteina NSP2 del ceppo CH-1a. Questo modello di delezione è coerente con quello di L8.7.3 (HP-PRRSV) (Figura 4(c)). Per indagare se DLF e DLW fossero coinvolti in un evento di ricombinazione, l'analisi utilizzando il software SimPlot e RDP4 ha rivelato che DLW ha subito un evento di ricombinazione (siti di ricombinazione che coprono nt 3500-5657), mentre DLW no (Figura 4(b)). Sulla base di studi precedenti e dei criteri utilizzati in questo studio per distinguere i ceppi vaccinali dai ceppi di tipo selvatico, sia DLF che DLW erano ceppi di tipo selvatico.
# Segni clinici dei suinetti infetti
I suinetti sfidati sono stati pesati ogni 7 giorni e sono stati prelevati campioni di sangue a 0, 3, 5, 7, 10, 14 e 21 giorni per periodo. La procedura sperimentale è mostrata nella Figura 5(a).
I suinetti nei gruppi di sfida HuN4 e DLF hanno entrambi sviluppato sintomi clinici evidenti (tosse, letargia, indigestione e brividi) entro 2 giorni dall'esposizione. I suinetti nel gruppo di sfida DLW hanno mostrato segni clinici tipici dell'infezione da PRRSV entro 3 giorni dall'esposizione, con 3 su 5 suini infetti che hanno manifestato tosse, letargia, indigestione e tremori. I suinetti nel gruppo di sfida HuN4 hanno mantenuto una febbre alta (≥40,5°C) per 4–6 giorni (Figura 5(b)) e hanno iniziato a morire entro 12 giorni dall'esposizione, con un tasso di sopravvivenza del 20% entro 21 giorni dall'esposizione (Figura 5(c)). I suinetti nel gruppo di sfida DLF hanno iniziato a morire entro 16 giorni dall'esposizione, con un tasso di sopravvivenza del 60% entro 21 giorni dall'esposizione (Figura 5(c)). Nonostante un tasso di mortalità inferiore, la durata della febbre in questo gruppo è stata più lunga (7–15 giorni) (Figura 5(b)). I suinetti nel gruppo di sfida DLW sono sopravvissuti fino alla fine dell'esperimento, con una durata della febbre più breve (1–8 giorni) (Figura 5(b)). I suinetti nel gruppo di controllo non hanno mostrato alcun sintomo clinico evidente e sono sopravvissuti per tutto lo studio (Figura 5(b, c)).
Figura 5(b) Andamento della temperatura rettale dopo la sfida con DLF, DLW e HuN4.
Figura 5(c) Tassi di sopravvivenza dopo la sfida con DLF, DLW e HuN4.
I pesi dei suinetti sono stati misurati a 0, 7, 14 e 21 dpi. L'analisi statistica ha mostrato che l'aumento medio di peso giornaliero (ADG) dei suinetti nel gruppo sfidato con DLF era significativamente inferiore a quello dei suinetti non infetti da 1 a 7 dpi, da 8 a 14 dpi e da 15 a 21 dpi (Figura 5(d)). Rispetto ai suinetti non infetti, l'ADG dei suinetti nel gruppo sfidato con HuN4 era significativamente inferiore da 8 a 14 dpi, mentre l'ADG dei suinetti nel gruppo sfidato con DLW era significativamente inferiore da 8 a 14 dpi e da 15 a 21 dpi (Figura 5(d)).
Figura 5(d) Variazioni medie dell'aumento di peso giornaliero nei gruppi sfidati con DLF, DLW e HuN4
I dati sono presentati come media ± deviazione standard (barre di errore). :p<0,05; :p<0,01; :p<0,001; ****:p<0,0001; ns: non statisticamente significativo.
# Variazioni dinamiche degli anticorpi specifici per il PRRSV
Sono stati prelevati campioni di sangue da tutti i suini a 0, 3, 5, 7, 10, 14 e 21 dpi e gli anticorpi specifici per la proteina N del PRRSV sono stati rilevati utilizzando un kit ELISA commerciale. I risultati hanno mostrato che gli anticorpi specifici per il PRRSV (rapporto S/P ≥ 0,4) sono stati rilevati nei suinetti nei gruppi sfidati con DLF e HuN4 a 10 dpi. A 14 dpi, tutti e cinque i suinetti nel gruppo sfidato con DLW erano positivi agli anticorpi (rapporto S/P ≥ 0,4). I rapporti S/P nei gruppi sfidati hanno continuato ad aumentare fino alla fine dell'esperimento, mentre non sono stati rilevati anticorpi specifici per il PRRSV nel gruppo non sfidato per tutto l'esperimento (Figura 5(e)).
# Valutazione della viremia e della carica virale in diversi tessuti
La reazione a catena della polimerasi quantitativa con trascrizione inversa (RT-qPCR) è stata utilizzata per analizzare la distribuzione della carica virale nei campioni di siero e in 10 tessuti ottenuti all'autopsia a 0, 3, 5, 7, 10, 14 e 21 giorni dopo la sfida. I risultati hanno mostrato che i livelli di viremia nei gruppi sfidati hanno iniziato ad aumentare a 3 giorni dopo la sfida, raggiungendo il picco a 5 giorni dopo la sfida nei gruppi DLF e DLW e a 7 giorni dopo la sfida nel gruppo HuN4 (Figura 5(f)). Le cariche virali sono poi gradualmente diminuite. Differenze significative nei livelli di viremia sono state osservate tra i gruppi sfidati da 7 a 10 giorni dopo la sfida (Figura 5(f)). La viremia non è stata rilevata nel gruppo di controllo per l'intero periodo di sfida. Sebbene siano state osservate differenze nelle cariche virali negli stessi tessuti tra i gruppi sfidati, queste differenze non erano statisticamente significative (Figura 5(g)). Il sequenziamento del gene ORF7 ha confermato che i campioni contenevano il ceppo di sfida originale.
Figura 5(f) Variazioni dinamiche della viremia indotta dalla sfida con DLF, DLW e HuN4
Figura 5(g) Analisi della carica virale in vari tessuti dei gruppi di sfida DLF, DLW e HuN4
# Lesioni macroscopiche e istopatologiche
Tutti i suinetti infettati da HuN4 hanno mostrato grave atrofia timica (Figura 6(a)). Quattro suinetti nel gruppo sfidato con DLF hanno mostrato una significativa atrofia timica, mentre nessuna atrofia timica è stata osservata nel gruppo sfidato con DLW (Figure 6(b,c)).
Tutti e cinque i suini nel gruppo sfidato con HuN4 hanno mostrato consolidamento polmonare (Figura 6(e)), di cui quattro avevano emorragia dei linfonodi mandibolari (Figura 6(m)). Dei cinque suini nel gruppo sfidato con DLF, tre avevano consolidamento polmonare (Figura 6(f)) e tre avevano emorragia dei linfonodi mandibolari (Figura 6(n)). Due dei cinque suini nel gruppo sfidato con DLW hanno mostrato consolidamento polmonare (Figura 6(g)) e due suini hanno avuto una lieve emorragia nei linfonodi mandibolari (Figura 6(o)). Non sono state osservate significative alterazioni patologiche nei tessuti degli organi dei suinetti non infetti (Figura 6(d,h,p)).
I suini sfidati con HuN4 hanno sviluppato una grave polmonite interstiziale con emorragia (Figura 6(i)), caratterizzata da ispessimento dei setti alveolari e infiltrazione di cellule mononucleate. Le lesioni microscopiche nei polmoni dei gruppi sfidati con DLF e DLW erano simili, ma differivano per gravità (Figura 6(j,k)). Il gruppo sfidato con DLF ha mostrato un'estesa infiltrazione di cellule infiammatorie con essudati sierosi, necrosi ed esfoliazione delle cellule epiteliali alveolari e significativa necrosi ed esfoliazione delle cellule epiteliali bronchiali (Figura 6(j)). Il gruppo sfidato con DLW ha mostrato un'estesa infiltrazione di cellule infiammatorie e un moderato allargamento dei setti alveolari (Figura 6(k)). Inoltre, rispetto al gruppo di controllo, i gruppi sfidati hanno mostrato diversi gradi di emorragia midollare nei linfonodi mandibolari (Figura 6(q-t)), mentre non sono state osservate lesioni patologiche in questi tessuti nei suini di controllo (Figura 6(i,t)).
Figura 6 Lesioni polmonari macroscopiche e istologiche in diversi gruppi di sfida
I suinetti sfidati con HuN4 o DLF hanno mostrato diversi gradi di atrofia timica (a, b). Rispetto al gruppo di controllo, i gruppi di infezione da HuN4 e DLF hanno sviluppato una grave polmonite interstiziale con consolidamento polmonare (e, f) ed emorragia dei linfonodi (i, j), mentre il gruppo di infezione da DLW ha mostrato una polmonite interstiziale più lieve con consolidamento polmonare (g) ed emorragia dei linfonodi (o). I tessuti polmonari dei gruppi sfidati hanno mostrato diversi gradi di polmonite interstiziale, caratterizzata da un'estesa infiltrazione di cellule infiammatorie, iperplasia epiteliale alveolare e allargamento dei setti alveolari (i-k). Inoltre, sono state osservate emorragie midollari nei linfonodi mandibolari dei gruppi sfidati (q-t), ma non nel gruppo di controllo (r).
Conclusione
Il lignaggio L8.7 è il primo lignaggio PRRSV scoperto in Cina ed è in circolazione da oltre 25 anni. Nel 2006, l'HP-PRRSV, un ceppo derivato dal PRRSV classico, ha causato un'epidemia in Cina caratterizzata da febbre alta, morbilità e mortalità. Successivamente, questo ceppo si è diffuso ampiamente in tutta la Cina e in Asia, subendo significative mutazioni. In particolare, l'HP-PRRSV e le sue varianti sono diventati i ceppi dominanti in Cina, ma la ricerca sui modelli epidemiologici, l'evoluzione molecolare e la patogenicità del nuovo PRRSV L8.7 rimane sottosviluppata. Pertanto, questo studio si è concentrato sul PRRSV L8.7 e ha condotto un'analisi completa e sistematica.
L'attenzione dei ceppi L8.7 si è concentrata principalmente sulla loro patogenicità, in particolare dall'epidemia del 2006 causata dal ceppo L8.7.3 (HP-PRRSV). Pertanto, questo studio ha isolato e valutato la patogenicità dei ceppi simili all'HP-PRRSV più dominanti (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) all'interno del lignaggio L8.7. I risultati hanno mostrato che, sebbene la virulenza dei ceppi simili all'HP-PRRSV (DLF e DLW) fosse ridotta rispetto all'HP-PRRSV (HuN4) (come evidenziato dall'aumento della sopravvivenza dei suinetti, dall'aumento dell'aumento di peso giornaliero, dalla diminuzione della temperatura e della durata della febbre e dalle differenze nell'atrofia timica), hanno comunque mostrato una significativa patogenicità. La virulenza in questo studio era correlata alla carica virale sierica nei suinetti sfidati a 7 e 10 giorni dopo l'inoculazione, mentre non sono state osservate differenze significative in altri momenti. Pertanto, il tasso di sopravvivenza, la temperatura e la durata della febbre e l'atrofia timica sono indicatori importanti della patogenicità del PRRSV nei suinetti.
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