Em 2006, o HP-PRRSV, que evoluiu do PRRSV clássico, causou uma epidemia na China caracterizada por alta febre, morbidade e mortalidade.A estirpe espalhou-se por toda a China e Ásia.O HP-PRRSV e as suas variantes tornaram-se as estirpes dominantes na China, mas a investigação sobre padrões epidemiológicos, evolução molecular,e patogenicidade do novo L8.7 O PRRSV permanece limitado.
Em 22 de Maio de 2025, a study titled "Genetic Evolution and Pathogenic Variation of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus" published in the journal Taylor & Francis systematically explained the epidemic dynamics, tendências evolutivas, associações de estirpes de vacinas e leis de evolução da patogenicidade da linhagem L8.7.
O presente estudo fornece dados fundamentais de apoio para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e controlo do PRRSV L8.7.
Resumo
Com base na análise de 2.509 sequências genéticas globais L8.7 ORF5, a linhagem L8.7 foi dividida em sete grupos (L8.7.1-L8.7.7). L8.7.1-L8.7.3 correspondem, respectivamente, ao PRRSV clássico, às estirpes intermediárias e ao HP-PRRSV, enquanto que o L8.7.4-L8.7.7 são definidos como PRRSV semelhantes a HP.
A análise estatística mostrou que os PRRSVs semelhantes ao HP predominaram na linhagem L8. 7, com L8.7.5 e L8.7A análise abrangente do genoma inteiro revelou que 72,15% das estirpes L8,7 apresentavam características de tipo selvagem.
A análise da taxa evolutiva revelou que a taxa evolutiva da L8.7.3-L8.7. 7 linhagens na China diminuiu aproximadamente 4, 1 vezes desde a introdução da vacina atenuada contra o VPH- PRRSV (VMP).
Os testes de patogenicidade revelaram que, em comparação com o HP-PRRSV (L8.7.3: HuN4), estirpes semelhantes ao HP-PRRSV (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) mantêm uma alta virulência, apresentando uma patogenicidade reduzida em leitões.
# Abstracto gráfico
Resultados experimentais
# Classificação do L8.7 PRRSV
Para analisar as características evolutivas do PRRSV L8.7, este estudo analisou um total de 2509 sequências ORF5: 2159 sequências de estirpes L8.7 foram obtidas a partir da base de dados do NCBI,e 350 sequências foram coletadas no nosso laboratório entre 2014 e 2023 (Figura 1 ((a))Como se mostra na figura, as estirpes L8.7 foram divididas em sete grupos (L8.7.1 ¢8.7.7) (Figuras 1 ((a, b)); todas as informações sobre a sequência estão disponíveis (Figura 2).
Tal como mostrado na figura 1 (b), as estirpes de referência utilizadas para a construção da árvore filogenética eram de estirpes clássicas conhecidas e de estirpes L8.7 PRRSV relatadas em estudos de patogenicidade.As distâncias genéticas médias dentro e entre os grupos são mostradas na Figura 1 (c)Com exceção do L8.7.2No total, as distâncias genéticas entre os grupos variaram de 4,3% a 10,4%.7.4-L.7As cepas de.7 exibiram padrões específicos de mutação de aminoácidos com características diferentes e foram definidas como HP-PRRSV-like.23% (56/2509) pertenciam à L8.7.1 (PRRSV semelhante ao CH-1a), 4,74% (119/2509) a L8.7.2 (PRRSV intermediário), 11,48% (288/2509) a L8.7.3 (HP-PRRSV), e 81,54% (2046/2509) para HP-PRRSV-like.
Figura 1 Árvore filogenética e análise de identidade de nucleotídeos das estirpes L8.7
(a) Árvore filogenética que divide as sequências L8.7 em sete grupos. (b) Árvore filogenética construída com base no gene ORF5 de L8.7 PRRSV isolados e estirpes de referência de PRRSV de cada linhagem.As estirpes experimentais utilizadas neste estudo estão marcadas com estrelas amarelasc) Distanças genéticas no interior e entre os grupos de estirpes L8.7 (percentagem de diferenças nucleotídicas).
Figura 2 Análise comparativa da patogenicidade do PRRSV L8.7.1-L8.7.7
# Distribuição global do PRRSV L8.7
Este estudo analisou de forma abrangente as sequências L8.7 para as quais são conhecidas informações temporais e geográficas.7.4 foi o mais difundido, cobrindo oito dos nove países onde as cepas L8.7 foram encontradas (Figura 3 ((a, b)).7.4Não foram encontrados outros grupos.7.1, 8.7.3, 8.7.5, 8.7.6, e 8.7.7 cepas foram encontradas em dois, três, quatro, quatro e dois países, respectivamente (Figura 3 ((a, b)).7.2 só foi notificada na China (Figura 3 ((b)). O número (2201/2509, 87,7%) e a diversidade (7/7 grupos, 100%) das estirpes L8.7 do PRRSV na China ocuparam o primeiro lugar (Figura 3 ((b)).
Figura 3 (a) Distribuição geográfica das estirpes L8.7 em diferentes regiões do mundo Figura 3 (b) Distribuição nacional das estirpes L8.7
Este estudo analisou um total de 2.201 cepas de PRRSV L8.7 da China. A infecção por PRRSV L8.7 foi relatada em 26 províncias da China, sendo a província de Guangdong a que mais casos foram reportados,seguida de Guangxi, Heilongjiang, Shandong, Hebei e Henan, com cada um mais de 40 casos notificados (Figura 3 (c, d)).com picos distintos de prevalência em grupos específicosGrupos L8.7.1 e L8.7.2 foram detectadas em taxas muito baixas e raramente foram notificadas desde 2006.7.3, após ter causado um surto em 2006, tornou-se dominante e persistiu de 2006 a 2009.
Figura 3 (c) Distribuição geográfica das estirpes L8.7 nas diferentes regiões da China Figura 3 (d) Distribuição populacional das estirpes L8.7 nas várias províncias da China
PRRSVs de tipo HP (L8.7.4-8.7.7) substituíram gradualmente o HP-PRRSV como estirpes predominantes em circulação na China (Figura 3 (e)).7.4 foi notificada e monitorizada pela primeira vez na China em 2006 e representou uma proporção significativa das estirpes L8.7 na China entre 2009 e 2011 (41,3%-79,6%).alguns grupos experimentaram aumentos repentinos na prevalência: por exemplo, grupo L8.7.5A prevalência da L8 é mais frequente na Europa do que em outros países, mas a sua prevalência tem aumentado significativamente desde 2011 (17,1%-51,6%) (Figura 3 (f)).7Este grupo (EU709835.1, SH02) foi identificada pela primeira vez em 2002. Inicialmente, a sua taxa de detecção foi extremamente baixa (apenas uma estirpe), e não foi detectada entre 2003 e 2005.A sua prevalência diminuiu gradualmente até 2009Em seguida, tornou-se a estirpe predominante entre 2014 e 2023, representando de 21,5% a 47,1%. Grupo L8.7.6 foi mais frequentemente detectado na China (612/2201, 27,8%) e teve a mais ampla distribuição (20/21 províncias, 95,2%) (Figura 3 ((d, f)).7.7 foi detectada pela primeira vez em 2008, mas sua prevalência permaneceu baixa até 2011, após o que aumentou gradualmente. Sua taxa de detecção aumentou rapidamente para 15,1% a 17,1% entre 2022 e 2023.
Figura 3 (e) Distribuição das estirpes L8.7 ao longo do tempo com base em sequências ORF5. Figura 3 (f) Gráfico de barras empilhado de frequências relativas na China.
Estes resultados revelam que, na última década, L8.7.5 e L8.7As estirpes.6 não só eram as mais abundantes, mas também as mais amplamente distribuídas na China.
# Relação entre MLVs HP-PRRSV e HP-PRRSV
Para investigar a associação entre as vacinas atenuadas pelo HP- PRRSV (JXA1- R, HuN4- F112, TJM- F92, GDr180) e estirpes semelhantes ao HP- PRRSV, este estudo analisou de forma abrangente estirpes do L8.7.4 ¢8.7.7 linhagens baseadas na identidade dos nucleotídeos, nas assinaturas de deleção NSP2 e nas alterações características dos aminoácidos em todo o genoma (quadro 1).
Quadro 1 Análise da associação genómica entre a vacina atenuada contra o VPRRSP-HP (VPM) e as estirpes similares ao VPRRSP-HP
Os resultados indicam que a chave para distinguir o PRRSV parecido com a vacina das cepas parecidas com o HP-PRRSV não pode ser determinada pela identidade do nucleótido do genoma inteiro ou pelas alterações características dos aminoácidos,Mas sim pela presença de eliminações adicionais do NSP2 (Tabela 1)A análise estatística revelou que 27,85% (22/79) da população L8.7.6 linhagem foram associadas à vacina.
Patogenicidade das estirpes HP-PRRSV e HP-PRRSV-like em leitões
# Isolamento e identificação de estirpes dominantes do tipo HP-PRRSV
Para esclarecer sistematicamente a patogenicidade das cepas dominantes de HP-PRRSV (L8.7.5 e L8.7.6), este estudo isolou com êxito o L8.7.5 estirpes de linhagem DLF e L8.7.6 estirpe de linhagem DLW. Estes vírus foram isolados a partir de macrófagos alveolares (PAM) e células Marc-145 de suínos.O ensaio IFA mostrou que a expressão da proteína PRRSV M foi observada em PAMs e células Marc-145 inoculadas com a estirpe (Figura 4 ((a)))., indicando que as estirpes DLF e DLW foram separadas com êxito.
Figura 4 Isolamento, cultura, análise de recombinação e alinhamento característico dos aminoácidos NSP2 da estirpe L8.7
a) Identificação das estirpes DLW e DLF.O ensaio de imunofluorescência (IFA) utilizando um anticorpo monoclonal dirigido à proteína PRRSV M revelou reactividade específica nas células PAM e Marc-145 do grupo de controlo., grupos infectados por DLF, DLW e HuN4. Os núcleos celulares foram contracoloridos com DAPI. Barra de escala = 300 μm. b) Análise dos eventos de recombinação em DLW.c) Alinhamento das sequências de aminoácidos deduzidas das proteínas NSP2 da L8.7 estirpes.
# Características genómicas da DLF e da DLW
O comprimento total do genoma de DLF (PQ178809) e DLW (PQ178810) é de 15.324 e 15.323 nucleotídeos, respectivamente (excluindo a cauda poli(A).HuN4/DLW e DLF/DLW foram 980,67%, 95,78% e 95,13%, respectivamente (conforme indicado no quadro abaixo).
O alinhamento da sequência da proteína NSP2 revelou que DLF e DLW apresentaram deleções discontinuas de 30 aminoácidos (1 + 29 aminoácidos) nas posições 482 e 533-561 na proteína NSP2 da estirpe CH-1a.Este padrão de eliminação é consistente com o da L8.7.3 (HP-PRRSV) (Figura 4 (c)). Para investigar se DLF e DLW estiveram envolvidos num evento de recombinação,A análise com o software SimPlot e RDP4 revelou que o DLW experimentou um evento de recombinação (locais de recombinação que abrangem nt 3500-5657), enquanto o DLW não (Figura 4 ((b)). Com base nos dois estudos anteriores e nos critérios utilizados neste estudo para distinguir estirpes de vacinas de estirpes de tipo selvagem, tanto o DLF como o DLW eram estirpes de tipo selvagem.
Os sinais clínicos dos leitões infectados
Os leitões desafiados foram pesados a cada 7 dias e as amostras de sangue recolhidas a 0, 3, 5, 7, 10, 14 e 21 dias por iodo.
Os leitões dos grupos de desafio HuN4 e DLF desenvolveram sintomas clínicos óbvios (tosse, letargia, indigestão e calafrios) 2 dias após a exposição.Os leitões do grupo de desafio DLW apresentaram sinais clínicos típicos de infecção pelo PRRSV 3 dias após a exposição.Os leitões do grupo de desafio HuN4 mantiveram uma febre elevada (≥ 40,5%).5°C) durante 4 ̊6 dias (Figura 5 (b)) e começou a morrer 12 dias após a exposição., com uma taxa de sobrevivência de 20% 21 dias após a exposição (Figura 5 (c)). Os leitões do grupo de desafio DLF começaram a morrer 16 dias após a exposição,com uma taxa de sobrevivência de 60% em 21 dias após a exposição (Figura 5 ((c))Apesar de uma taxa de mortalidade mais baixa, a duração da febre neste grupo foi mais longa (715 dias) (Figura 5 (b)).com uma duração de febre mais curta (1 ̊8 dias) (Figura 5 ̊ b))Os leitões do grupo de controlo não apresentaram quaisquer sintomas clínicos óbvios e sobreviveram ao longo do estudo (Figura 5 (b, c)).
Figura 5 (b) Tendências da temperatura do reto após o ensaio com DLF, DLW e HuN4.
Figura 5 (c) Taxas de sobrevivência após o desafio com DLF, DLW e HuN4.
Os pesos dos leitões foram medidos em 0, 7, 14 e 21 dpi.A análise estatística mostrou que o aumento médio de peso diário (ADG) dos leitões no grupo com DLF foi significativamente inferior ao dos leitões não infectados, de 1 a 7 dpi., de 8 a 14 dpi e de 15 a 21 dpi (Figura 5 ((d)). Em comparação com leitões não infectados, a ADG dos leitões do grupo afectado pelo HuN4 foi significativamente mais baixa, de 8 a 14 dpi,Enquanto o ADG dos leitões no grupo desafiado pela DLW foi significativamente mais baixo, de 8 a 14 dpi e de 15 a 21 dpi (Figura 5 ((d)).
Figura 5 (d) Alterações médias do ganho de peso diário nos grupos com DLF, DLW e HuN4
Os dados são apresentados como média ± desvio-padrão (barras de erro). :p<0.05; :p<0.01; :p<0.001; ****: p<0.0001; ns: não são estatisticamente significativos.
# Mudanças dinâmicas nos anticorpos específicos do PRRSV
Foram colhidas amostras de sangue de todos os suínos a 0, 3, 5, 7, 10, 14 e 21 dpi, e foram detectados anticorpos específicos para a proteína PRRSV N utilizando um kit ELISA comercial.Os resultados mostraram que os anticorpos específicos do PRRSV (ratio S/ P ≥ 0.4) foram detetados em leitões dos grupos com DLF e HuN4 a 10 dpi. Em 14 dpi, todos os cinco leitões do grupo com DLW eram positivos em anticorpos (ratio S/P ≥ 0,4).Os rácios S/P nos grupos desafiados continuaram a aumentar até ao final da experiência, enquanto não foram detectados anticorpos específicos do PRRSV no grupo não contestado ao longo do experimento (Figura 5 ((e)).
# Avaliação da viremia e da carga viral em diferentes tecidos
A reação em cadeia de polimerase transcrição- quantitativa inversa (RT- qPCR) foi utilizada para analisar a distribuição da carga viral em amostras séricas e 10 tecidos obtidos na autópsia em 0, 3, 5, 7, 10, 14, 15 e 20 anos.e 21 dias após o desafioOs resultados mostraram que os níveis de viremia nos grupos desafiados começaram a aumentar 3 dias após o desafio,Pico 5 dias após o desafio nos grupos DLF e DLW e 7 dias após o desafio no grupo HuN4 (Figura 5 ((f))As cargas virais diminuíram então gradualmente. Diferenças significativas nos níveis de viremia foram observadas entre os grupos desafiados de 7 a 10 dias após o desafio (Figura 5 ((f)).Não foi detectada viremia no grupo de controlo durante todo o período de ensaioApesar de se terem observado diferenças nas cargas virais nos mesmos tecidos entre os grupos submetidos a teste, estas diferenças não foram estatisticamente significativas (Figura 5 ((g)).O sequenciamento do gene ORF7 confirmou que as amostras continham a estirpe de desafio original.
Figura 5 (f) Alterações dinâmicas da viremia induzidas pelo desafio de DLF, DLW e HuN4
Figura 5 ((g) Análise da carga viral em vários tecidos dos grupos de desafio DLF, DLW e HuN4
# Lesões Grossas e Histopatológicas
Todos os leitões infetados com HuN4 apresentaram uma atrofia do timo grave (Figura 6 ((a)).Considerando que não foi observada nenhuma atrofia do timo no grupo afectado pela DLW (Figuras 6b), c).
Todos os cinco suínos do grupo submetido ao tratamento com HuN4 apresentaram consolidação pulmonar (Figura 6 ((e))), dos quais quatro apresentaram hemorragia dos gânglios linfáticos mandibulares (Figura 6 ((m)).Três tinham consolidação pulmonar (Figura 6 ((f)) e três tinham hemorragia dos gânglios linfáticos mandibulares (Figura 6 ((n))Dois dos cinco suínos do grupo submetido a DLW apresentaram consolidação pulmonar (Figura 6 (g)) e dois suínos apresentaram hemorragia leve nos gânglios linfáticos mandibulares (Figura 6 (o)).Não foram observadas alterações patológicas significativas nos tecidos orgânicos dos leitões não infectados (Figura 6 ((d), h, p)).
Os suínos tratados com HuN4 desenvolveram pneumonia intersticial grave com hemorragia (Figura 6 ((i))), caracterizada por espessamento do septo alveolar e infiltração de células mononucleares.As lesões microscópicas nos pulmões dos grupos desafiados por DLF e DLW foram semelhantes., mas diferiram em gravidade (Figura 6 ((j,k)). O grupo desafiado pela DLF apresentou uma extensa infiltração de células inflamatórias com exsudados sorosos, necrose e esfoliação das células epiteliais alveolares,e necrose e esfoliação significativas das células epiteliais dos brônquios (Figura 6 ((j))O grupo submetido à DLW apresentou uma extensa infiltração de células inflamatórias e uma ampliação moderada do septo alveolar (Figura 6 (k)).Os grupos desafiados apresentaram diferentes graus de hemorragia medular nos gânglios linfáticos mandibulares (Figura 6 ((q-t)), considerando que não foram observadas lesões patológicas nestes tecidos nos suínos de controlo (Figura 6 (i,t)).
Figura 6 Lesões pulmonares grossas e histológicas em diferentes grupos de desafio
Os leitões testados com HuN4 ou DLF apresentaram graus variados de atrofia do timo (a, b).Os grupos com infecção por HuN4 e DLF desenvolveram pneumonia intersticial grave com consolidação pulmonar (e, f) e hemorragia nos gânglios linfáticos (i, j), enquanto o grupo de infecção por DLW apresentou pneumonia intersticial mais leve com consolidação pulmonar (g) e hemorragia nos gânglios linfáticos (o).Os tecidos pulmonares dos grupos testados apresentaram diferentes graus de pneumonia intersticial, caracterizada por uma extensa infiltração de células inflamatórias, hiperplasia epitelial alveolar e alargamento da septa alveolar (i- k).foram observadas hemorragias medulares nos gânglios linfáticos mandibulares dos grupos afectados (q-t), mas não no grupo de controlo (r).
Conclusão
A linhagem L8.7 é a primeira linhagem de PRRSV descoberta na China e circula há mais de 25 anos.causou uma epidemia na China caracterizada por febre altaNo entanto, a taxa de mortalidade e de morbidade da variante foi reduzida, e a taxa de mortalidade aumentou.O HP-PRRSV e as suas variantes tornaram-se as estirpes dominantes na China, mas a pesquisa sobre os padrões epidemiológicos, evolução molecular e patogenicidade do novo L8.7 PRRSV permanece subdesenvolvida.7 PRRSV e conduziu uma análise abrangente e sistemática.
O foco das estirpes L8.7 tem sido principalmente a sua patogenicidade, particularmente desde o surto de 2006 causado pela L8.7Por conseguinte, este estudo isolou e avaliou a patogenicidade das estirpes mais dominantes semelhantes ao HPV (L8.7.5: DLF; L8.7.6Os resultados mostraram que, embora a virulência das estirpes semelhantes ao HP-PRRSV (DLF e DLW) fosse reduzida em comparação com a HP-PRRSV (HuN4) (como evidenciado pelo aumento da sobrevivência dos leitões, a virulência das estirpes semelhantes ao HP-PRRSV (DLF e DLW) foi reduzida em comparação com a virulência das estirpes semelhantes ao HP-PRRSV (HuN4)).aumento de peso diário, diminuição da temperatura e da duração da febre, e diferenças na atrofia do timo), continuavam a apresentar patogenicidade significativa.A virulência neste estudo foi correlacionada com a carga viral sérica em leitões testados aos 7 e 10 dias após a inoculação.Por conseguinte, a taxa de sobrevivência, a temperatura e a duração da febree a atrofia do timo são importantes indicadores da patogenicidade do PRRSV em leitões.
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