W 2006 roku HPV-PRRSV, szczep pochodzący z klasycznego PRRSV, wywołał epidemię w Chinach charakteryzującą się wysoką gorączką, zachorowalnością i śmiertelnością.szczep rozprzestrzenił się po całej Chinach i AzjiHP-PRRSV i jego odmiany stały się dominującymi szczepami w Chinach, ale badania nad epidemiologią, ewolucją molekularną i patogennością nowej L87 PRRSV pozostaje ograniczone.
W dniu 22 maja 2025 r. a study titled "Genetic Evolution and Pathogenic Variation of Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus" published in Taylor & Francis systematically elucidated the epidemiological dynamics, tendencje ewolucyjne, skojarzenia szczepów szczepionkowych i ewolucja patogenności linii L8. 7.
Niniejsze badanie dostarcza kluczowych danych wspierających opracowanie strategii zapobiegania i kontroli L8.7 PRRSV.
Abstrakt
Na podstawie analizy 2509 globalnych sekwencji genów L8.7 ORF5 linia L8.7 została podzielona na siedem grup (L8.7.1-L8.7.7). L8.7.1-L8.7.3 odpowiadają zgłoszonym klasycznym PRRSV, szczepom pośrednim i HP-PRRSV, natomiast L8.7.4-L8.7.7 są definiowane jako PRRSV podobne do HP.
Analiza statystyczna wykazała, że w linii L8. 7 dominowały PRRSV podobne do HP, z L8.7.5 i L8.7.6 szczepów, co stanowi najwyższy odsetek w ostatnich latach.
Analiza tempa ewolucji wykazała, że tempa ewolucji L8.7.3-L8.7Od czasu wprowadzenia osłabionej szczepionki przeciwko HPV- PRRSV (MLV) liczba szczepionek przeciwko HPV w Chinach zmniejszyła się około 4, 1 razy.
Badania patogenności wykazały, że w porównaniu z HPV- PRRSV (L8.7.3: HuN4), szczepy podobne do HP-PRRSV (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) utrzymują wysoką wirulencję, wykazując jednocześnie zmniejszoną patogenność u prosiąt.
# Abstrakcja graficzna
Wyniki eksperymentów
# Klasyfikacja L8.7 PRRSV
Aby przeanalizować ewolucyjne cechy PRRSV L8.7, w tym badaniu przeanalizowano łącznie 2509 sekwencji ORF5: 2159 sekwencji szczepów L8.7 uzyskano z bazy NCBI,i 350 sekwencji zebrano w naszym laboratorium w latach 2014-2023 (rysunek 1 ((a))Jak pokazano na rysunku, szczepy L8.7 podzielono dalej na siedem grup (L8.7.1 ¢8.7.7) (rys. 1 ((a, b)); wszystkie informacje o sekwencji są dostępne (rys. 2).
Jak pokazano na rysunku 1 (b), szczepy referencyjne wykorzystane do skonstruowania drzewa filogenetycznego pochodziły z znanych szczepów klasycznych oraz ze szczepów L8.7 PRRSV zgłoszonych w badaniach patogenności.Średnie odległości genetyczne w obrębie i między grupami przedstawiono na rysunku 1 (c).Z wyjątkiem L8.7.2, średnie odległości genetyczne we wszystkich grupach wynosiły mniej niż 5%.7.4-L.7Wśród 2509 sekwencji w populacji L8.7, 2.23% (56/2509) należało do L8.7.1 (PRRSV podobny do CH-1a), 4,74% (119/2509) do L8.7.2 (przedmiotowy PRRSV), 11,48% (288/2509) do L8.7.3 (HP-PRRSV) i 81,54% (2046/2509) do HP-PRRSV podobnego.
Rysunek 1 Drzewo filogenetyczne i analiza tożsamości nukleotydów szczepów L8.7
(a) Drzewo filogenetyczne dzielące sekwencje L8.7 na siedem grup. (b) Drzewo filogenetyczne skonstruowane na podstawie genu ORF5 izolatów L8.7 PRRSV i szczepów PRRSV referencyjnych z każdej linii.Szczepy eksperymentalne wykorzystane w tym badaniu oznaczone są żółtymi gwiazdkamic) Odległości genetyczne w obrębie grup szczepów L8.7 i między nimi (odsetek różnic nukleotydowych).
Rysunek 2 Porównawcza analiza patogenności PRRSV L8.7.1-L8.7.7
# Globalna dystrybucja PRRSV L8.7
W tym badaniu przeanalizowano kompleksowo sekwencje L8.7, dla których znane są informacje czasowe i geograficzne.7.4 był najbardziej rozpowszechniony, obejmując osiem z dziewięciu krajów, w których stany L8.7 zostały znalezione (rysunek 3 ((a, b)).7.4Nie stwierdzono żadnych innych grup.7.1, 8.7.3, 8.7.5, 8.7.6, i 8.7.7 szczepów stwierdzono odpowiednio w dwóch, trzech, czterech, czterech i dwóch krajach (rysunek 3 ((a, b)).7Liczba (2201/2509, 87,7%) i różnorodność (7/7 grup, 100%) szczepów L8.7 PRRSV w Chinach zajęły pierwsze miejsce (rysunek 3 ((b)).
Rysunek 3 a) Rozkład geograficzny szczepów L8.7 w różnych regionach świata Rysunek 3 b) Rozkład krajowy szczepów L8.7
W tym badaniu przeanalizowano łącznie 2 201 szczepów L8.7 PRRSV z Chin. Zakażenie L8.7 PRRSV odnotowano w 26 prowincjach w Chinach, z czego prowincja Guangdong odnotowała najwięcej przypadków,po której następuje Guangxi, Heilongjiang, Shandong, Hebei i Henan, z ponad 40 zgłoszonymi przypadkami (rysunek 3 (c, d)).z wyraźnymi szczytami występowania w określonych grupachGrupy L8.7.1 i L8.7.2 zostały wykryte w bardzo niskich częstotliwościach i rzadko zgłaszane od 2006 r. Grupa L8.7.3, po wywołaniu ogniska w 2006 r., stał się dominujący i utrzymywał się w latach 2006-2009.
Rysunek 3 (c) Rozkład geograficzny szczepów L8.7 w różnych regionach Chin Rysunek 3 (d) Rozkład populacji szczepów L8.7 w różnych prowincjach Chin.
PRRSV podobne do HP (L8.7.4-8.7.7) stopniowo zastępowały HP-PRRSV jako dominujące szczepy krążące w Chinach (rysunek 3 (e)).7.4 po raz pierwszy zgłoszono i monitorowano w Chinach w 2006 r. i stanowiła znaczną część szczepów L8.7 w Chinach w latach 2009-2011 (41,3%-79,6%).w niektórych grupach obserwowano nagły wzrost częstości występowania: np. grupa L8.7.5, która po raz pierwszy pojawiła się w Chinach w 2007 r. i nieprzerwanie krąży, odnotowała znaczny wzrost częstości występowania od 2011 r. (17,1%-51,6%) (rysunek 3 ((f)).7Należy również zwrócić uwagę na szczep.6.1, SH02) została po raz pierwszy zidentyfikowana w 2002 r. Początkowo jej wskaźnik wykrywania był niezwykle niski (tylko jeden szczep) i nie został wykryty w latach 2003-2005.jego częstość stopniowo zmniejszała się do 2009 r.Następnie stał się dominującym szczepem w latach 2014-2023, stanowiąc od 21,5% do 47,1%.7.6 najczęściej wykryto w Chinach (612/2201, 27,8%) i miał najszersze rozpowszechnienie (20/21 prowincji, 95,2%) (rysunek 3 ((d, f)).7.7 został po raz pierwszy wykryty w 2008 r., ale jego częstość występowania pozostała niska do 2011 r., po czym stopniowo wzrastała.
Rysunek 3 (e) Rozkład szczepów L8.7 w czasie na podstawie sekwencji ORF5. Rysunek 3 (f) Zestawiony wykres pręgowy w odniesieniu do częstotliwości w Chinach.
Wyniki te pokazują, że w ciągu ostatniej dekady L8.7.5 i L8.7Szczepy.6 były nie tylko najpowszechniejsze, ale również najbardziej rozpowszechnione w Chinach.
# Stosunek między HP-PRRSV MLV a HP-PRRSV
Aby zbadać związek między szczepionkami osłabionymi HPV- PRRSV (JXA1- R, HuN4- F112, TJM- F92, GDr180) a szczepami podobnymi do HPV- PRRSV, badanie to kompleksowo analizowało szczepy L8.7.4 ¢8.7.7 linii na podstawie tożsamości nukleotydów, podpisów delecji NSP2 oraz charakterystycznych zmian aminokwasów w całym genomie (tabela 1).
Tabela 1 Analiza genomowego związku między szczepionką osłabioną przeciwko HPV-PRRSV (MLV) a szczepami podobnymi do HPV-PRRSV
Wyniki wskazują, że kluczem do odróżnienia szczepionkowego PRRSV od szczepów HP-PRRSV nie może być identyfikacja nukleotydów całego genomu lub charakterystyczne zmiany aminokwasów,ale raczej przez obecność dodatkowych usunięć NSP2 (tabela 1)Analiza statystyczna wykazała, że 27,85% (22/79)7.6 szczepy rodowe były związane z szczepionką.
Patogenność szczepów HP-PRRSV i podobnych do HP-PRRSV u prosiąt
# Izolacja i identyfikacja dominujących szczepów podobnych do HP-PRRSV
Systematyczne wyjaśnienie patogenności dominujących szczepów HP-PRRSV (L8.7.5 i L8.7.6), w tym badaniu z powodzeniem odizolowano L8.7.5 szczep linii DLF i L8.7.6 szczep linii DLW. Wirusy te zostały wyizolowane z makrofagów alveolarnych świń (PAM) i komórek Marc-145.Badanie IFA wykazało, że ekspresja białka PRRSV M była obserwowana w komórkach PAM i komórkach Marc-145, zaszczepionych szczepem (rysunek 4 ((a)))., co wskazuje, że szczepy DLF i DLW zostały z powodzeniem oddzielone.
Rysunek 4 Izolacja, hodowla, analiza rekombinacji i charakterystyczne wyrównanie aminokwasów NSP2 ze szczepem L8.7
a) Identyfikacja szczepów DLW i DLF.Badanie immunofluorescencyjne (IFA) z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych skierowanych do białka PRRSV M wykazało specyficzną reaktywność w komórkach PAM i komórkach Marc-145 z grupy kontrolnej., grupy zakażone DLF, DLW i HuN4. Jądra komórkowe były przeciwbarwione DAPI. Barka skali = 300 μm. b) Analiza zdarzeń rekombinacyjnych w DLW.c) Ustawienie wywodzonych sekwencji aminokwasów białek NSP2 z L8.7 szczepów.
# Cechy genomowe DLF i DLW
Pełna długość genomu DLF (PQ178809) i DLW (PQ178810) wynosi odpowiednio 15,324 i 15,323 nukleotydów (z wyłączeniem ogona poli(A).HuN4/DLW i DLF/DLW wynosiły 980,67%, 95,78% i 95,13% odpowiednio (jak pokazano w poniższej tabeli).
Wykonanie sekwencyjnego wyrównania białka NSP2 wykazało, że DLF i DLW wykazywały niespójne delecje 30 aminokwasów (1 + 29 aminokwasów) na pozycjach 482 i 533-561 w białku NSP2 szczepu CH-1a.Ten wzór usunięcia jest zgodny z L8.7.3 (HP-PRRSV) (rysunek 4 (c)). Aby zbadać, czy DLF i DLW były zaangażowane w zdarzenie rekombinacji,Analiza za pomocą oprogramowania SimPlot i RDP4 wykazała, że DLW doświadczyło zdarzenia rekombinacji (miejsca rekombinacji obejmujące 3500-5657Na podstawie zarówno wcześniejszych badań, jak i kryteriów stosowanych w tym badaniu w celu odróżnienia szczepów szczepionki od szczepów dzikiego typu, zarówno DLF, jak i DLW były szczepami dzikiego typu.
# Znaki kliniczne zakażonych prosiąt
Prosiątki poddawane badaniom były ważone co 7 dni, a próbki krwi pobrane były po 0, 3, 5, 7, 10, 14 i 21 dniach na jod.
Rysunek 5 (a) Projekt eksperymentalny
Świnki w grupach wyzwania HuN4 i DLF rozwinęły oczywiste objawy kliniczne (kaszel, letargia, niestrawność i dreszcze) do 2 dni po ekspozycji.Świnki w grupie wyzwania DLW wykazywały typowe objawy kliniczne zakażenia PRRSV 3 dni po ekspozycjiW grupie wyzwania HuN4 świnki utrzymywały wysoką gorączkę (≥ 40 stopni).5°C) przez 4 ̇6 dni (rysunek 5 (b)) i zaczęła umierać w ciągu 12 dni po ekspozycjiPo 21 dniach od ekspozycji wskaźnik przeżycia wynosił 20% (rysunek 5 (c)).z współczynnikiem przeżycia wynoszącym 60% do 21 dni po ekspozycji (rysunek 5 ((c))Pomimo niższego wskaźnika śmiertelności, czas trwania gorączki w tej grupie był dłuższy (7-15 dni) (rysunek 5 (b)).z krótszym czasem trwania gorączki (18 dni) (rysunek 5 ((b))Świnki w grupie kontrolnej nie wykazywały żadnych wyraźnych objawów klinicznych i przetrwały przez całe badanie (rysunek 5 (b, c)).
Rysunek 5 (b) tendencje temperatury odbytnicy po wyzwaniu z DLF, DLW i HuN4.
Rysunek 5 ((c) Wskaźniki przeżycia po podjęciu wyzwania z DLF, DLW i HuN4.
Waga prosiąt została zmierzona w 0, 7, 14 i 21 dpi.Analiza statystyczna wykazała, że średni dzienny przyrost masy (ADG) prosiąt w grupie dotkniętej DLF był znacznie niższy niż u prosiąt niezakażonych od 1 do 7 dpi., 8 do 14 dpi i 15 do 21 dpi (rysunek 5 ((d)). W porównaniu z niezakażonymi prosiakami, ADG prosiąt w grupie poddawanej próbie HuN4 była znacznie niższa, od 8 do 14 dpi,podczas gdy ADG prosiąt w grupie poddawanej DLW była znacznie niższa, z 8 do 14 dpi i z 15 do 21 dpi (rysunek 5 ((d)).
Rysunek 5 (d) Średnie dzienne zmiany przyrostu masy ciała w grupach DLF, DLW i HuN4-Challenged
Dane są przedstawiane jako średnia ± odchylenie standardowe (przewody błędów). :p<0.05; :p<0.01; :p<0.001; ****:p<0.0001; ns: nie jest istotny statystycznie.
# Dynamiczne zmiany w przeciwciałach specyficznych dla PRRSV
Próbki krwi pobrano od wszystkich świń w 0, 3, 5, 7, 10, 14 i 21 dpi, a przeciwciała specyficzne dla białka PRRSV N wykryto za pomocą komercyjnego zestawu ELISA.Wyniki wykazały, że przeciwciała specyficzne dla wirusa PRRSV (stosunek S/ P ≥ 0.4) zostały wykryte u prosiąt w grupach poddanych DLF i HuN4 przy 10 dpi. Do 14 dpi wszystkie pięć prosiąt w grupie poddanej DLW były przeciwciałami dodatnimi (względ S/P ≥ 0,4).Wskaźniki S/P w grupie poddanej wyzwaniu nadal rosły do końca eksperymentu, podczas gdy w grupie nie poddanej badaniom nie wykryto przeciwciał specyficznych dla PRRSV w trakcie całego eksperymentu (rysunek 5 (e)).
Rysunek 5 (e) Zmiany w tytach przeciwciał przeciwko PRRSV wywołane wyzwaniem DLF, DLW i HuN4.
# Ocena wiremii i obciążenia wirusowego w różnych tkankach
RT-qPCR wykorzystano do analizy rozmieszczenia obciążenia wirusowego w próbkach surowicy i 10 tkankach uzyskanych podczas autopsji po 0, 3, 5, 7, 10, 14 i 21 dniu po wyzwaniu.Wyniki wykazały, że stężenie wiremii w grupie poddanej wyzwaniu zaczęło wzrastać po 3 dniach od rozpoczęcia badania., osiągając szczyt po 5 dniach od wyzwania w grupach DLF i DLW i po 7 dniach od wyzwania w grupie HuN4 (rysunek 5 (f)).Znaczące różnice w poziomie wiremii obserwowano w okresie od 7 do 10 dni po podaniu próby (rysunek 5 ((f))Nie wykryto wiremii w grupie kontrolnej w całym okresie badania, chociaż obserwowano różnice w obciążeniu wirusowym w tych samych tkankach wśród grup poddanych badaniom.różnice te nie były istotne statystycznie (rysunek 5 ((g))Sekwencjonowanie genu ORF7 potwierdziło, że próbki zawierają pierwotny szczep.
Rysunek 5 (f) Zmiany dynamiczne wiremii wywołane wyzwaniem DLF, DLW i HuN4
Rysunek 5 ((g) Analiza obciążenia wirusowego w różnych tkankach grup wyzwania DLF, DLW i HuN4
# Łączne i histopatologiczne zmiany
Wszystkie prosiątki zakażone HuN4 wykazywały ciężką atrofie tarczycy (rysunek 6 ((a)).U grupy poddawanej DLW nie zaobserwowano żadnej atrofii tarczy (rys. 6b), c)).
Wszystkie pięć świń w grupie poddawanej próbie HuN4 wykazywało konsolidację płuc (rysunek 6 ((e))), z czego cztery miały krwotoki w węzłach chłonnych szczęki (rysunek 6 ((m)).trzy miały konsolidację płuc (rysunek 6 ((f)) i trzy miały krwotoki z węzłów chłonnych szczęki (rysunek 6 ((n))Dwie z pięciu świń w grupie poddanej DLW wykazywały konsolidację płuc (rysunek 6 (g)) oraz dwie świnie miały lekkie krwawienie w węzłach chłonnych szczęki (rysunek 6 (o)).Nie zaobserwowano istotnych zmian patologicznych w tkankach narządów niezakażonych prosiąt (rysunek 6 ((d), h, p)).
Świnie poddawane próbie HuN4 rozwinęły ciężkie zapalenie płuc międzykręgowe z krwotokiem (rysunek 6 ((i))), charakteryzujące się zgrubieniem septy pęcherzowej i infiltracją komórek mononuklearnych.Mikroskopowe zmiany w płucach w grupach poddanych DLF i DLW były podobne., ale różniły się w stopniu nasilenia (rysunek 6 ((j, k)). Grupa poddawana DLF wykazała rozległą infiltrację komórek zapalnych wyładowanymi serami, martwicę i łuszczenie komórek nabłonkowych pęcherzowych,i znaczącą martwicę i łuszczenie komórek nadgarstkowych oskrzeli (rysunek 6 ((j))W grupie poddanej badaniu DLW wykazano rozległą infiltrację komórek zapalnych i umiarkowane poszerzenie sieci płciowej (rysunek 6 (k)).w badanych grupach występowało różne stopnie krwawienia rdzenia w węzłach chłonnych szczęki (rysunek 6 ((q-t)), podczas gdy u świń kontrolnych nie zaobserwowano żadnych patologicznych zmian w tych tkankach (rysunek 6 (i,t)).
Rysunek 6 Uszkodzenia płuc grubo i histologiczne w różnych grupach wyzwania
Świnki poddawane próbie HuN4 lub DLF wykazywały różny stopień zaniku tymu (a, b).w grupie z zakażeniem HuN4 i DLF rozwinęło się ciężkie zapalenie płucne z konsolidacją płuc (e, f) i krwawienia w węzłach chłonnych (i, j), podczas gdy w grupie zakażonej DLW wystąpiło łagodniejsze zapalenie płucne z konsolidacją płuc (g) i krwawienie w węzłach chłonnych (o).W tkankach płuc z grup poddanych badaniom występował różny stopień zapalenia płuc interstycyjnego., charakteryzujące się rozległą infiltracją komórek zapalnych, hiperplazją nabłonka alweolarowego i poszerzeniem septu alweolarowego (i- k).obserwowano krwawienia rdzenia w węzłach chłonnych szczęki grup poddawanych badaniom (q-t), ale nie w grupie kontrolnej (r).
Wniosek
Linia L8.7 jest najwcześniejszą linią PRRSV odkrytą w Chinach i krąży od ponad 25 lat.wywołał epidemię w Chinach charakteryzującą się wysoką gorączkąNastępnie szczep ten rozprzestrzenił się szeroko w Chinach i Azji, przechodząc znaczącą mutację.HP-PRRSV i jego odmiany stały się głównymi szczepami w Chinach, ale badania nad wzorcami epidemiologicznymi, ewolucją molekularną i patogennością nowej L8.7 PRRSV pozostają niedorozwinięte.7 PRRSV i przeprowadził kompleksową i systematyczną analizę.
Szczepy L8.7 koncentrują się przede wszystkim na ich patogenności, zwłaszcza od czasu wybuchu L8 w 2006 r.7W związku z tym w niniejszym badaniu wyizolowano i oceniono patogenność najbardziej dominujących szczepów podobnych do HPV (L8.7.5: DLF; L8.7.6Wyniki wykazały, że chociaż wirulencja PRRSV podobnego do HP (DLF i DLW) była zmniejszona w porównaniu do HP- PRRSV (HuN4) (co wynika z zwiększonej przeżywalności prosiąt), w przypadku PRRSV podobnych do HP (DLF i DLW) występowała większa ryzyko wystąpienia wirusów, niż w przypadku PRRSV podobnych do HP (HuN4).zwiększenie dziennego przyrostu masy ciała, zmniejszona temperatura i czas trwania gorączki, a także różnice w zanieczyszczeniu tarczy, nadal utrzymywała znaczącą patogenność.Wirulencja w tym badaniu korelowała z obciążeniem wirusowym w surowicy u prosiąt poddanych badaniom po 7 i 10 dniach na 1000 (dpi)W związku z powyższym wskaźnik przeżycia, temperatura i czas trwania gorączkii zanieczyszczenia tarczy są ważnymi wskaźnikami patogenności PRRSV u prosiąt.
Odkąd w Chinach w 2016 r. rozpowszechnił się PRRSV linii L1, raporty o szczepach rekombinowanych wzrosły.7 z L1 (L1W tym badaniu DLW był rekombinowanym szczepem L8.7 i L1.8 (zorzec rekombinacji: L8.7+L1.8), a jego patogenność była niższa niż u HuN4 i DLF.Chociaż DLW wykazała znacząco zmniejszoną patogenność u prosiąt, związek między zmniejszoną wirulencją a zdarzeniem rekombinacji wymaga dalszych badań.7.1 (niska patogenność) i L8.7.2 (niska patogenność), szczep L8.7.3 wykazała wysoką patogenność u prosiąt w połączeniu z wcześniej zgłoszonymi eksperymentami patogenności na szczepach L8.7.5 (2006) i L8.7.6 (2017), PRRSV podobne do HP (L8.7.4 ¢8.7.7) utrzymywała wysoką wirulencję, wykazując jednocześnie zmniejszoną patogenność u prosiąt w porównaniu ze szczepem L8.7.3 (zob. rysunek 2).
Rysunek 2 Porównawcza analiza patogenności PRRSV L8.7.1-L8.7.7
# Dyskusja Poglądy
1Implikacje kliniczne ewolucji patogenności
Badania na zwierzętach wykazały, że szczepy podobne do HP (takie jak DLW/L8.7.6), przy mniejszym wskaźniku śmiertelności niż klasyczny HP-PRRSV (HuN4), może powodować uporczywą wysoką gorączkę (> 41°C), zahamowanie wzrostu i podwyższone obciążenie wirusowe w węzłach chłonnych.pomimo, że nie doświadczyła ostrej śmierci, wystąpią trwałe objawy układu oddechowego i wtórne infekcje.Zaleca się łączenie sekwencjonowania ORF5 i analizy histopatologicznej podczas diagnozy, aby uniknąć błędnej klasyfikacji szczepów podobnych do HP jako szczepów o niskiej patogenności..
2Optymalizacja strategii zapobiegania i kontroli
Biorąc pod uwagę "efekt antygrawitacyjny" przenoszenia wirusów (środki bezpieczeństwa biologicznego w dużych gospodarstwach wieprzowych zmniejszają ryzyko zakażenia), małe i średnie gospodarstwa powinny być przedmiotem zapobiegania i kontroli.Ponadto, szybkie rozprzestrzenianie się L8.7.6 szczep w stadach świń wymaga ulepszonego zarządzania zamkniętym pętlem i wzmocnionych badań.
Twoja wiadomość musi mieć od 20 do 3000 znaków!