Em 2006, o HP-PRRSV, uma cepa derivada do PRRSV clássico, causou uma epidemia na China caracterizada por alta febre, morbidade e mortalidade. Posteriormente, a tensão se espalhou amplamente pela China e Ásia, passando por mutações significativas. O HP-PRRSV e suas variantes se tornaram as cepas dominantes na China, mas pesquisas sobre a epidemiologia, evolução molecular e patogenicidade do novo L8.7 PRRSV permanecem limitadas.
Em 22 de maio de 2025, um estudo intitulado "Evolução genética e variação patogênica do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória por porcina altamente patogênica" publicada em Taylor e Francis elucidou sistematicamente a dinâmica epidemiológica, tendências evolutivas, associações de deformação e patogenicidade da lineação L8.7.
Este estudo fornece suporte aos principais dados para o desenvolvimento de estratégias de prevenção e controle de PRRSV L8.7.
Resumo
Com base na análise de 2.509 sequências genéticas globais de L8.7 ORF5, a linhagem L8.7 foi dividida em sete grupos (L8.7.1-L8.7.7). L8.7.1-L8.7.3 corresponde a PRRSV clássico relatado, cepas intermediárias e HP-PRRSV, respectivamente, enquanto L8.7.4-L8.7.7 são definidas como prrsvs do tipo HP.
A análise estatística mostrou que os PRRSVs do tipo HP predominavam na linhagem L8.7, com cepas de L8.7.5 e L8.7.6 representando a maior proporção nos últimos anos. A análise abrangente do genoma inteiro revelou que 72,15% das cepas de L8.7 exibiram características do tipo selvagem.
A análise da taxa evolutiva revelou que a taxa evolutiva das linhagens L8.7.3-L8.7.7 na China diminuiu aproximadamente 4,1 vezes desde a introdução da vacina atenuada de HP-PRRSV (MLV).
Os testes de patogenicidade revelaram que, em comparação com a HP-PRRSV (L8.7.3: HUN4), cepas do tipo HP-PRRSV (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) mantêm alta virulência enquanto exibe patogenicidade reduzida em leitões.
# Resumo gráfico
Resultados experimentais
# Classificação de L8.7 PRRSV
Para analisar as características evolutivas do PRRSV L8.7, este estudo analisou um total de 2509 sequências ORF5: 2159 L8.7 sequências de deformação foram obtidas no banco de dados do NCBI e 350 sequências foram coletadas em nosso laboratório entre 2014 e 2023 (Figura 1 (a)). Como mostrado na figura, as cepas de L8.7 foram divididas em sete grupos (L8.7.1–8.7.7) (Figuras 1 (a, b)); Todas as informações de sequência estão disponíveis (Figura 2).
Como mostrado na Figura 1 (b), as cepas de referência usadas para construir a árvore filogenética eram de cepas clássicas conhecidas e cepas de PRRSV de L8.7 relatadas em estudos de patogenicidade. As distâncias genéticas médias dentro e entre os grupos são mostradas na Figura 1 (c). Com exceção de L8.7.2, as distâncias genéticas médias em todos os grupos foram inferiores a 5%. No geral, as distâncias genéticas entre os grupos variaram de 4,3% a 10,4%. Além disso, as cepas L8.7.4-l.7.7 exibiram padrões específicos de mutação de aminoácidos com características diferentes e foram definidos como do tipo HP-PRRSV. Among the 2509 sequences in the L8.7 population, 2.23% (56/2509) belonged to L8.7.1 (CH-1a-like PRRSV), 4.74% (119/2509) to L8.7.2 (intermediate PRRSV), 11.48% (288/2509) to L8.7.3 (HP-PRRSV), and 81.54% (2046/2509) para HP-PRRSV.
Figura 1 Análise de identidade filogenética e nucleotídica de cepas de L8.7
(a) Árvore filogenética Dividindo seqüências L8.7 em sete grupos. (B) Árvore filogenética construída com base no gene ORF5 de isolados de L8.7 PRRSV e referência a cepas de PRRSV de cada linhagem. As cepas experimentais usadas neste estudo são marcadas com estrelas amarelas. (c) Distâncias genéticas dentro e entre os grupos de deformação L8.7 (porcentagem de diferenças de nucleotídeos).
Figura 2 Análise comparativa da patogenicidade do PRRSV L8.7.1-L8.7.7
# Distribuição global de PRRSV L8.7
Este estudo analisou de forma abrangente sequências L8.7 para as quais são conhecidas informações temporais e geográficas. Notavelmente, o grupo L8.7.4 foi o mais difundido, cobrindo oito dos nove países onde foram encontradas cepas de L8.7 (Figura 3 (A, B)). Nepal, Laos e Mianmar detectaram apenas um único grupo, L8.7.4; Nenhum outro grupo foi encontrado. L8.7.1, 8.7.3, 8.7.5, 8.7.6 e 8.7.7 As cepas foram encontradas em dois, três, quatro, quatro e dois países, respectivamente (Figura 3 (A, B)). A cepa L8.7.2 foi relatada apenas na China (Figura 3 (b)). O número (2201/2509, 87,7%) e a diversidade (7/7 grupos, 100%) das cepas de PRRSV de L8,7 na China classificaram em primeiro lugar (Figura 3 (b)).
Figura 3 (a) Distribuição geográfica de cepas de L8.7 em diferentes regiões do mundo. Figura 3 (b) Distribuição nacional de linhagens L8.7.
Este estudo analisou um total de 2.201 L8.7 cepas de PRRSV da China. L8.7 A infecção por PRRSV foi relatada em 26 províncias na China, com a província de Guangdong relatando mais casos, seguida por Guangxi, Heilongjiang, Shandong, Hebei e Henan, cada um com mais de 40 casos relatados (Figura 3 (C, D)). A prevalência de diferentes grupos PRRSV na China exibe dinâmica temporal (Figura 3 (e)), com picos distintos na prevalência em grupos específicos. Os grupos L8.7.1 e L8.7.2 foram detectados a taxas muito baixos e raramente foram relatados desde 2006. O grupo L8.7.3, depois de causar um surto em 2006, tornou -se dominante e persistiu de 2006 a 2009.
Figura 3 (c) Distribuição geográfica de cepas de L8.7 em diferentes regiões da China. Figura 3 (d) Distribuição populacional de linhagens L8.7 em várias províncias da China.
Os PRRSVs do tipo HP (L8.7.4-8.7.7) substituíram gradualmente o HP-PRRSV como as cepas circulantes predominantes na China (Figura 3 (e)). O Grupo L8.7.4 foi relatado e monitorado pela primeira vez na China em 2006 e compreendeu uma proporção significativa de cepas de L8.7 na China entre 2009 e 2011 (41,3%-79,6%). Notavelmente, alguns grupos sofreram aumentos repentinos na prevalência: por exemplo, o grupo L8.7.5, que apareceu pela primeira vez na China em 2007 e circula continuamente, viu um aumento significativo na prevalência desde 2011 (17,1%-51,6%) (Figura 3 (f)). A natureza cíclica da linhagem L8.7.6 também é digna de nota. Este grupo (EU709835.1, SH02) foi identificado pela primeira vez em 2002. Inicialmente, sua taxa de detecção foi extremamente baixa (apenas uma tensão) e não foi detectada entre 2003 e 2005. Após um aumento rápido em 2006, sua prevalência diminuiu gradualmente até 2009. Tornou -se então a tensão predominante entre 2014 e 20 e 2023. O grupo L8.7.6 foi detectado com mais frequência na China (612/2201, 27,8%) e teve a distribuição mais ampla (20/21 províncias, 95,2%) (Figura 3 (D, F)). O grupo L8.7.7 foi detectado pela primeira vez em 2008, mas sua prevalência permaneceu baixa até 2011, após o que aumentou gradualmente. Sua taxa de detecção aumentou rapidamente para 15,1% para 17,1% entre 2022 e 2023.
Figura 3 (e) Distribuição de cepas L8.7 ao longo do tempo com base nas sequências ORF5. Figura 3 (f) gráfico de barras empilhadas de frequências relativas na China.
Esses resultados revelam que, na última década, as cepas L8.7.5 e L8.7.6 não foram apenas as mais abundantes, mas também as mais amplamente distribuídas na China.
# Relacionamento entre HP-PRRSV MLVs e HP-PRRSVS
Para investigar a associação entre as vacinas atenuadas por HP-PRRSV (JXA1-R, HUN4-F112, TJM-F92, GDR180) e HP-PRRSV, este estudo de linhagens de linésias e linagens de linhagens de npina e linés, npina-npina, npina, com base na identidade de npina e linés, com base em linhagens, com base na identidade de npina e linagens de npina, npina, com base em linhagens, com base em linhagens de linhagens de npina e linagens de npina. 1).
Tabela 1 Análise de associação em todo o genoma entre a vacina atenuada por HP-PRRSV (MLV) e cepas do tipo HP-PRRSV
Os resultados indicam que a chave para distinguir PRRSV do tipo vacina de cepas do tipo HP-PRRSV não pode ser determinada pela identidade de nucleotídeos de genoma inteiro ou alterações características de aminoácidos, mas pela presença de deleções NSP2 adicionais (Tabela 1). A análise estatística revelou que 27,85% (22/79) das cepas de linhagem L8.7.6 estavam associadas à vacina.
Patogenicidade das cepas do tipo HP-PRRSV e HP-PRRSV em leitões
# Isolamento e identificação de cepas dominantes do tipo HP-PRRSV
Para elucidar sistematicamente a patogenicidade das cepas dominantes do tipo HP-PRRSV (L8.7.5 e L8.7.6), este estudo isolou com sucesso o dlw de linhagem L8.7.5 DLF e a linhagem L8.7.6 DLW. Esses vírus foram isolados de macrófagos alveolares porcinos (PAMs) e células MARC-145. O ensaio de IFA mostrou que a expressão da proteína PRRSV M foi observada nas células PAMs e Marc-145 inoculadas com a tensão (Figura 4 (a)), indicando que as cepas de DLF e DLW foram separadas com sucesso.
Figura 4 Isolamento, cultura, análise de recombinação e alinhamento característico de aminoácidos NSP2 da cepa L8.7
(a) Identificação das cepas DLW e DLF. Ensaio de imunofluorescência (IFA) usando um anticorpo monoclonal direcionado à proteína PRRSV M revelou reatividade específica em células PAMs e MARC-145 dos grupos de controle, infectados com DLF, infectados com DLW e infectados com HUN4. Os núcleos celulares foram contrastados com DAPI. Barra de escala = 300 μm. (b) Análise de eventos de recombinação no DLW. (c) Alinhamento das seqüências de aminoácidos deduzidas das proteínas NSP2 das cepas L8.7.
# Características genômicas de DLF e DLW
Os comprimentos completos do genoma de DLF (PQ178809) e DLW (PQ178810) são 15.324 e 15.323 nucleotídeos, respectivamente (excluindo a cauda poli (a)). As semelhanças com nucleotídeos genômicas entre HUN4/DLF, HUN4/DLW e DLF/DLW foram 98,67%, 95,78%e 95,13%, respectivamente (como mostrado na tabela abaixo).
O alinhamento de sequência da proteína NSP2 revelou que o DLF e o DLW exibiram deleções descontínuas de 30 aminoácidos (1 + 29 aminoácidos) nas posições 482 e 533-561 na proteína NSP2 CH-1A. Esse padrão de exclusão é consistente com o de L8.7.3 (HP-PRRSV) (Figura 4 (c)). Para investigar se o DLF e o DLW estavam envolvidos em um evento de recombinação, a análise usando o software Simplet e RDP4 revelou que o DLW experimentou um evento de recombinação (os locais de recombinação que abrangem o NT 3500-5657), enquanto o DLW não (Figura 4 (b)). Com base nos estudos anteriores e nos critérios utilizados neste estudo para distinguir cepas de vacina de cepas de tipo selvagem, o DLF e o DLW eram cepas de tipo selvagem.
# Sinais clínicos de leitões infectados
Os leitões desafiados eram pesados a cada 7 dias, e as amostras de sangue foram coletadas em 0, 3, 5, 7, 10, 14 e 21 dias por IOD. O procedimento experimental é mostrado na Figura 5 (a).
Figura 5 (a) Projeto experimental
Piglets nos grupos HUN4 e DLF desafiam, ambos desenvolveram sintomas clínicos óbvios (tosse, letargia, indigestão e calafrios) em 2 dias após a exposição. Os leitões do grupo de desafios DLW exibiram sintomas clínicos típicos da infecção por PRRSV em 3 dias após a exposição, com 3 dos 5 porcos infectados experimentando tosse, letargia, indigestão e tremores. Os leitões do grupo HUN4 desafiam a febre alta (≥40,5 ° C) por 4 a 6 dias (Figura 5 (b)) e começaram a morrer 12 dias após a exposição. A taxa de sobrevivência foi de 20% em 21 dias após a exposição (Figura 5 (c)). Os leitões do grupo de desafios do DLF começaram a morrer 16 dias após a exposição, com uma taxa de sobrevivência de 60% em 21 dias após a exposição (Figura 5 (c)). Apesar de uma menor taxa de mortalidade, a duração da febre nesse grupo foi maior (7 a 15 dias) (Figura 5 (b)). Os leitões do grupo de desafios DLW sobreviveram até o final do experimento, com uma duração mais curta da febre (1 a 8 dias) (Figura 5 (b)). Os leitões do grupo controle não mostraram sintomas clínicos óbvios e sobreviveram ao longo do estudo (Figura 5 (b, C)).
Figura 5 (b) Tendências de temperatura retal após desafio com DLF, DLW e HUN4.
Figura 5 (c) Taxas de sobrevivência após desafio com DLF, DLW e HUN4.
Os pesos de leitão foram medidos em 0, 7, 14 e 21 dpi. A análise estatística mostrou que o ganho médio de peso diário (ADG) de leitões no grupo com desafio DLF foi significativamente menor que o dos leitões não infectados de 1 a 7 dpi, 8 a 14 dpi e 15 a 21 dpi (Figura 5 (d)). Comparado com leitões não infectados, o ADG de leitões no grupo com desafiado HUN4 foi significativamente menor de 8 a 14 dpi, enquanto o ADG de leitões no grupo com desafio DLW foi significativamente menor de 8 a 14 dpi e de 15 a 21 dpi (Figura 5 (d)).
Figura 5 (d) Alterações médias de ganho diário de peso em grupos DLF, DLW e HUN4 com desafios
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (barras de erro). : p <0,05; : p <0,01; : p <0,001; ****: p <0,0001; NS: Não estatisticamente significativo.
# Mudanças dinâmicas em anticorpos específicos para PRRSV
As amostras de sangue foram coletadas de todos os porcos em 0, 3, 5, 7, 10, 14 e 21 dpi, e anticorpos específicos para a proteína PRRSV N foram detectados usando um kit ELISA comercial. Os resultados mostraram que os anticorpos específicos do PRRSV (relação S/P ≥ 0,4) foram detectados em leitões nos grupos DLF e HUN4 com 10 dpi. Em 14 DPI, todos os cinco leitões no grupo com desafio DLW foram positivos para anticorpos (relação S/P ≥ 0,4). As razões S/P nos grupos desafiados continuaram aumentando até o final do experimento, enquanto nenhum anticorpo específico do PRRSV foi detectado no grupo não contestado durante todo o experimento (Figura 5 (e)).
Figura 5 (e) Alterações nos títulos de anticorpos anti-PRRSV induzidos pelo desafio com DLF, DLW e HUN4.
# Avaliação da viremia e carga viral em diferentes tecidos
A RT-qPCR foi usada para analisar a distribuição de carga viral em amostras de soro e 10 tecidos obtidos em autópsia em 0, 3, 5, 7, 10, 14 e 21 dias após o desafio. Os resultados mostraram que os níveis de viremia nos grupos desafiados começaram a aumentar a partir de 3 dias após o desafio, chegando a 5 dias após o desafio nos grupos DLF e DLW e 7 dias após o desafio no grupo HUN4 (Figura 5 (F)). Cargas virais então recusaram gradualmente. Diferenças significativas nos níveis de viremia foram observadas entre 7 e 10 dias após o desafio (Figura 5 (f)). Nenhuma viremia foi detectada no grupo controle durante todo o período do desafio. Embora as diferenças nas cargas virais nos mesmos tecidos tenham sido observadas entre os grupos desafiados, essas diferenças não foram estatisticamente significativas (Figura 5 (g)). O sequenciamento do gene ORF7 confirmou que as amostras continham a cepa de desafio original.
Figura 5 (f) Alterações dinâmicas na viremia induzida por DLF, DLW e HUN4 Desafio
Figura 5 (g) Análise da carga viral em vários tecidos dos grupos de desafio DLF, DLW e HUN4
# Lesões brutas e histopatológicas
Todos os leitões infectados com HUN4 apresentaram atrofia tímica grave (Figura 6 (a)). Quatro leitões no grupo com desafio DLF exibiram atrofia tímica significativa, enquanto não foi observada atrofia tímica no grupo com desafio DLW (Figuras 6 (B, C)).
Todos os cinco porcos no grupo com desafio HUN4 exibiram consolidação de pulmão (Figura 6 (e)), dos quais quatro apresentaram hemorragia linfonodal mandibular (Figura 6 (m)). Dos cinco porcos no grupo com desafio DLF, três tinham consolidação pulmonar (Figura 6 (f)) e três apresentaram hemorragia linfonodal mandibular (Figura 6 (n)). Dois dos cinco porcos do grupo com desafio DLW exibiram consolidação pulmonar (Figura 6 (g)), e dois porcos apresentaram hemorragia leve nos linfonodos mandibulares (Figura 6 (O)). Não foram observadas alterações patológicas significativas nos tecidos órgãos dos leitões não infectados (Figura 6 (D, H, P)).
Os porcos desafiados com HUN4 desenvolveram pneumonia intersticial grave com hemorragia (Figura 6 (i)), caracterizada pelo espessamento dos septos alveolares e infiltração de células mononucleares. As lesões microscópicas nos pulmões do DLF e DLW desafiaram grupos foram semelhantes, mas diferiam na gravidade (Figura 6 (J, K)). O grupo desafiou o DLF mostrou uma extensa infiltração de células inflamatórias com exsudatos serosos, necrose e esfoliação de células epiteliais alveolares e necrose significativa e esfoliação de células epiteliais brônquicas (Figura 6 (j)). O grupo desafiado com DLW mostrou uma extensa infiltração de células inflamatórias e ampliação moderada dos septos alveolares (Figura 6 (k)). Além disso, em comparação com o grupo controle, os grupos desafiados mostraram graus variados de hemorragia medular nos linfonodos mandibulares (Figura 6 (QT)), enquanto não foram observadas lesões patológicas nesses tecidos nos porcos controle (Figura 6 (i, t)).
Figura 6 lesões pulmonares brutas e histológicas em diferentes grupos de desafios
Os leitões desafiados com HUN4 ou DLF exibiram graus variados de atrofia tímica (A, B). Comparado com o grupo controle, os grupos de infecção por HUN4 e DLF desenvolveram pneumonia intersticial grave com consolidação pulmonar (E, F) e hemorragia linfonodal (I, J), enquanto o grupo de infecção por DLW exibiu pneumonia intersticial mais suave com consolidação pulmonar (G) e Lhhhe Node Node Node Node Os tecidos pulmonares dos grupos desafiados exibiram graus variados de pneumonia intersticial, caracterizados por extensa infiltração de células inflamatórias, hiperplasia epitelial alveolar e alargamento dos septos alveolares (IK). Além disso, hemorragias medulares foram observadas nos linfonodos mandibulares dos grupos desafiados (QT), mas não no grupo controle (R).
Conclusão
A linhagem L8.7 é a primeira linhagem PRRSV descoberta na China e circula há mais de 25 anos. Em 2006, o HP-PRRSV, uma cepa derivada do PRRSV clássico, causou uma epidemia na China caracterizada por febre alta, morbidade e mortalidade. Posteriormente, essa cepa se espalhou amplamente pela China e Ásia, passando por mutação significativa. Notavelmente, o HP-PRRSV e suas variantes se tornaram as cepas dominantes na China, mas pesquisas sobre os padrões epidemiológicos, evolução molecular e patogenicidade do novo L8.7 prrsv permanece subdesenvolvido. Portanto, este estudo se concentrou em L8.7 PRRSV e conduziu uma análise abrangente e sistemática.
O foco das cepas de L8.7 tem sido principalmente sua patogenicidade, principalmente desde o surto de 2006 causado pela cepa L8.7.3 (HP-PRRSV). Portanto, este estudo isolou e avaliou a patogenicidade das cepas mais dominantes do HP-PRRSV (L8.7.5: DLF; L8.7.6: DLW) dentro da linhagem L8.7. Os resultados mostraram que, embora a virulência do PRRSV do tipo HP (DLF e DLW) tenha sido reduzida em comparação com o HP-PRRSV (HUN4) (como evidenciado pelo aumento da sobrevida dos leitões, aumento do ganho de peso diário, diminuição da temperatura e duração da febre e diferenças na atrofia tímica), ainda manteve a patogenicidade significativa. A virulência neste estudo correlacionou -se com a carga viral sérica em leitões desafiados em 7 e 10 dias por 1000 (DPI), enquanto não foram observadas diferenças significativas em outros momentos. Portanto, a taxa de sobrevivência, a temperatura e a duração da febre e a atrofia tímica são indicadores importantes da patogenicidade do PRRSV em leitões.
Desde que a linhagem L1 PRRSV tornou -se predominante na China em 2016, os relatos de cepas recombinantes aumentaram. Os padrões de recombinação predominante na China são L1 (L1.5 ou L1.8) com L8.7 ou L8.7 com L1 (L1.5 ou L1.8). Neste estudo, o DLW foi uma cepa recombinante de L8.7 e L1.8 (padrão de recombinação: L8.7+L1.8), e sua patogenicidade foi menor que a de HUN4 e DLF. Embora a DLW tenha mostrado patogenicidade significativamente reduzida nos leitões, a relação entre a virulência reduzida e o evento de recombinação requer uma investigação mais aprofundada. No geral, com exceção das cepas L8.7.1 (baixa patogenicidade) e L8.7.2 (baixa patogenicidade), a cepa L8.7.3 foi altamente patogênica em leitões. Combinados com experimentos de patogenicidade relatados anteriormente nas cepas L8.7.5 (2006) e L8.7.6 (2017), PRRSVs do tipo HP (L8.7.4-8.7.7) mantiveram alta virulência enquanto exibia patogenicidade reduzida em leitões em comparação com a cepa L8.7.3 (ver figura 2).
Figura 2 Análise comparativa da patogenicidade do PRRSV L8.7.1-L8.7.7
# Discussão Viewpoints
1. Implicações clínicas da evolução da patogenicidade
Experimentos em animais mostraram que cepas semelhantes a HP (como DLW/L8.7.6), embora tenham uma menor taxa de mortalidade do que a clássica HP-PRRSV (HUN4), pode causar febre alta persistente (> 41 ° C), inibição do crescimento e cargas virais de linfonodos elevados. Isso explica por que alguns casos, apesar de não sofrer morte aguda, desenvolvem sintomas respiratórios persistentes e infecções secundárias. Recomenda-se que o sequenciamento do ORF5 e a análise histopatológica sejam combinados durante o diagnóstico para evitar a classificação incorreta do tipo HP como cepas baixas patogênicas.
2. Otimização das estratégias de prevenção e controle
Dado o "efeito anti-gravidade" da transmissão viral (medidas de biossegurança em fazendas de porcos em larga escala reduzem o risco de infecção), pequenas e médias fazendas devem ser o foco de prevenção e controle. Além disso, a rápida propagação da linhagem L8.7.6 nos rebanhos de porco requer gerenciamento de circuito fechado atualizado e testes aprimorados.
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