أخبار الشركة عن مشاركة أحدث الأبحاث. انتشار أنواع GIII من فيروسات الجيتافيرس مع زيادة فيروسية في مزارع الخنازير في مقاطعة هنان.

فيروس جيتا (GETV) هو فيروس ناشئ ينقل بواسطة البعوض يهدد مجموعة واسعة من الحيوانات والبشر. من يوليو إلى سبتمبر 2024,حدثت تفشي مركز لفيروس التهاب الخنازير في مزارع الخنازير في مقاطعة هنان، مما يمثل واحدة من أكثر تفشي المرض انتشارًا وتركيزًا في البر الرئيسي للصين في السنوات الأخيرة.

من يوليو إلى سبتمبر 2024، حدث تفشي مركز لفيروس جيتا (GETV) في مزرعات خنازير متعددة في مقاطعة هنان. تم عزل 27 سلالة من 31 مزرعة خنازير،22 منها شكلت مجموعة فريدة من نوعها في الشجرة الوراثية وأظهرت طفرات الأحماض الأمينية في بروتينات nsP3 و E2.

أظهرت التجارب أن هذا المتغير GIII أظهرت زيادة كبيرة في المرض في الخنازير ، مع معدل وفيات 100٪ ، وأظهرت أيضا مرضية عالية في الفئران.هذه الدراسة هي أول تحقيق منهجي في تفشي GETV على نطاق واسع في مزارع خنازير هنان، مما يكشف عن زيادة في الفيروسية والخصائص الجزيئية لمتغير GIII.

مقدمة

فيروس غيتا (GETV) هو فيروس RNA ذو سلاسل واحدة ذات حاسة إيجابية يصيب مجموعة واسعة من الحيوانات وقد يشكل تهديداً للبشر. من يوليو إلى سبتمبر 2024,حدثت تفشي مركز لفيروس GETV في مزارع الخنازير التجارية في مقاطعة هنان، مما أدى إلى عزل 27 سلالة. كان المتغير GIII السلالة المسببة للأمراض السائدة ، مع إظهار زيادة في الفيروسات مقارنة بالسلالات السابقة.توفر هذه الدراسة مرجعية لفهم علم الأوبئة الجزيئي والمرضوية لـ GETV.

المواد والأساليب

استخدمت هذه الدراسة خلايا BHK-21 و PK-15 لزراعة عزل GETV الخنزير HNJZ-S1. تم استخراج حمض النوائي الفيروسي من مزارع الخنازير المصابة بالعدوى المشتبه فيها في هنان و شانشي ، وتم تخليق cDNA.تم الكشف عن الفيروسات بواسطة PCR/RT-PCRتم عزل العينات الإيجابية وتطهيرها وتحديدها في الخلايا. تم تحديد خصائص نمو الفيروسات وتشكيل اللويحات. تم تضخيم جين E2 والجينوم بأكمله، وتم استنساخه،ويتم تسلسلها لتحديد التسلسلات وتحليلات التناسل.

في التجارب على الحيوانات، تم حقن الخنازير السلبية لـ GETV والفئران التي تمرضها من قبل SPF منذ يومين بالفيروس عن طريق العضلات أو تحت الجلد.وقد تم قياس الحمولات الفيروسية في الدم والأنسجةتم استخراج الحمض النووي الريبوزي الفيروسي من عينات الأنسجة ، وتم تخليق الحمض النووي المشترك ، ثم تم الكشف عنها بواسطة SYBR Green qPCR. يتم تقديم البيانات كمتوسط ± SD وتحليلها باستخدام GraphPad Prism 9.0.

نتائج البحث

1جمع العينات واكتشاف الفيروسات

في يوليو 2024، وقع تفشي مرتفع للوفيات في الخنازير البالغة من العمر 3 إلى 10 أيام في مزرعة خنازير في تشوماديان، مقاطعة هنان، مع معدل مرض بلغ 30٪ ومعدل وفيات بلغ 80٪.أظهر تأكيد المختبر أن تفشي المرض ناجم عن سلالة واحدة من GETVفي وقت لاحق، وقعت تفشيات مشتبه بها في مزرعات الخنازير في جميع أنحاء مقاطعة هنان.كشف جمع العينات السريرية عن تفشي في 12 من أصل 18 مدينة على مستوى المحافظة و 21 من أصل 157 مقاطعة (الشكل 1 ((أ))من يوليو إلى سبتمبر ، كان هناك تفشي واحد و 15 و 16 ، على التوالي. كانت الأعراض الرئيسية في الخنازير الإسهال الشديد ، والانقطاع ، وضعف الأطراف الخلفية.التشريحات كشفت عن التورم والتهاب الغدد الليمفاوية النزفية، نزيفات رئوية، نزيفات سطحية متناثرة، وتورم تحت الجلد (الشكل 1 ((ب)). من بين 36 عينة إيجابية لفيروس GETV، تم إصابة اثنين فقط بالفيروس PDCoV أو PCV2 أو JEV.الباقي مصاب بفيروس GETV واحد (الشكل 1 ((ج)).

الشكل الأول: لمحة عامة عن تفشي فيروس التهاب الخنازير في مزارع الخنازير في مقاطعة هنان

(أ) توزيع مزارع الخنازير المصابة بفيروس التهاب الخنازير في مقاطعة هنان. (ب) الآفات النسيجية الكبيرة في الخنازير المصابة خلال هذه الفاشية.

(ج) تحديد PCR لفيروس GETV والفيروسات الأخرى في عينات الأنسجة.

الاستنتاج: حدثت عدوى GETV في الخنازير في مزرعات متعددة في مقاطعة هنان ، والتي تسببها في المقام الأول فيروس واحد. تشمل المظاهر السريرية الإسهال ، والإصابة بالتهاب الدم ، وضعف الأطراف الخلفية ،مع عدوى مختلطة تحدث في عينة قليلة.

2عزل، تحديد، وتحديد عنوان GETV

من 36 عينة إيجابية، تم عزل 28 سلالة من GETV بنجاح في خلايا BHK-21. تم تحديد HNzk-XH1 و HNzmd-XP1 على أنها GETV. بعد 48 ساعة من العدوى في خلايا BHK-21 أو PK-15, تم تحديد HNzk-XH1 و HNzmd-XP1 على أنها GETV.التغيرات الحيوية الكبيرةتمت ملاحظة الاختزالات المختلفة، بما في ذلك تقلص الخلايا وتقريبها وتقشيرها، بالمقارنة مع المراقبة. أكد RT-PCR والمجهر الإلكتروني على الهوية الفيروسية.أظهرت منحنيات الانتشار أن حركية نمو السلالات الفيروسية كانت متشابهةأظهرت نتائج تحليل اللويحات أن اللويحات من سلالات الفيروسين كانت متشابهة في الحجم، ولكنها تختلف في العدد.

الشكل 2. عزل وتوصيف GETV

(أ) بعد إصابة خلايا BHK-21 و PK-15 بـ HNzk- XH1 أو HNzmd- XP1 ، لوحظ تأثيرات الحمض النووي في غضون 12 إلى 36 ساعة.

(ب) تم تحديد عزلات GETV عن طريق RT-PCR. (ج) تم فحص مورفولوجيا جسيمات GETV عن طريق المجهر الإلكتروني.

(د) نمو HNzk-XH1 أو HNzmd-XP1 في خلايا BHK-21 و PK-15.

الاستنتاج: تم عزل سلالات GETV HNzk-XH1 و HNzmd-XP1 بنجاح من عينات مزارع الخنازير. كلتا السلالتين تسببت في تأثيرات سيتوباتية كبيرة في الخلايا.مع حركة نمو مماثلة وتغيرات في الدرجة، ولكن مع اختلاف في أعداد البلاك.

3. تسلسل وتحليل النباتات

تم تقديم تسلسلات الجينوم بأكمله (أرقام الانضمام إلى GenBank: PQ658739PQ658750) وسلسلة جين E2 (أرقام الانضمام إلى GenBank: PQ658751PQ658766) التي تم الحصول عليها في هذه الدراسة إلى GenBank.أظهر تحليل التجانس الجيني بأكمله أن هوية النيوكليوتيدات بين العزلات تتراوح من 98.4٪ إلى 100.0٪ ، وتراوحت هوية الأحماض الأمينية من 99.3٪ إلى 100.0٪. بالمقارنة مع سلالة المرجعية ، كانت هويات النيوكليوتيدات لهذه العزلات مع GI و GII و GIV و GIII 94.8٪ ٪ 95.0٪ ، 960.9% ٪97.0٪، 95.6% ٪97.3٪، و 96.9% ٪99.8٪، على التوالي. كانت هويات الأحماض الأمينية 98.5% ٪98.8٪، 98.9% ٪99.1٪، 98.3% ٪99.5٪، و 98.7% ٪100.0٪ على التوالي.

كشف التحليل النباتي القائم على جينات E2 من 28 عزل و 12 جينوم كامل أن جميع العزلات تنتمي إلى GIII ، ذات صلة بعيدة مع المجموعات الأخرى (الشكل 3 ((أ ، ب)).معظمها تم تجميعها مع المتغير GDHYLC23 (الشكل 3 ((ب))أظهر محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية أربعة طفرات فريدة في بروتينات nsP3 و E2 من هذه العزلات (الشكل 3 ((ج)). يقع طفرة nsP3 P329S في منطقة ZBD ،تتواجد طفرات A381T و V503G في منطقة HVD، و البروتين E2 لديه طفرة D323E في الموقف 323. بناءً على هذه الخصائص ، تم تحديد العزلات في هذا الفصيل على أنها متغيرات GIII.

الشكل 3. التحليل النباتي وتحديد تسلسل الأحماض الأمينية للمعزلات. التحليل النباتي للمعزلات على أساس E2 (أ) والجينوم الكامل (ب).

الاستنتاج: جميع العزلات في هذه الدراسة تنتمي إلى النمط الجيني GIII ، ذات صلة بعيدة بالنماط الجينية الأخرى ، وتمتلك طفرات حمض أميني فريدة في بروتينات nsP3 و E2 ،يؤكد أن هذه العزلات هي المتغيرات GIII.

4المرضية للسلالة GETV HNzk-XH1 في الخنازير

نظراً لمعدل الوفيات المرتفع لانتشار فيروس GETV في مزارع الخنازير التجارية وارتفاع مستوى فيروسات GETV المعزولة من خلايا BHK-21 و PK-15 ،تم اختيار سلالة HNzk-XH1 ذات الدرجة العالية لتقييم الجراثيم في هذه الدراسةتم حقن الخنازير في مجموعة التحدي بعين العضلات مع 107TCID50 من سلالة HNzk-XH1 ، في حين تم حقن المجموعة المراقبة بمقدار متساو من الوسيط DMEM.أربعة وعشرون ساعة بعد التحدي، تطورت الإسهال في الخنازير في مجموعة التحدي، تليها شلل الأطراف الخلفية بعد 1.5 أيام. بعد يومين، توفي بعض الخنازير، وفي غضون أربعة أيام توفي جميع الخنازير.الوصول إلى معدل وفيات 100٪ (الشكل 4 ((ج))أظهرت درجات الأعراض السريرية أن مجموعة HNzk-XH1 كانت تعاني من أعراض أكثر شدة بكثير من مجموعة التحكم (الشكل 4 ((ب)). تم تشريح الخنازير الميتة على الفور ،بينما تم تشريح مجموعة التحكم بعد 8 أيامكان جدار الأمعاء الدقيقة لمجموعة HNzk-XH1 رقيقًا بشكل ملحوظ ، مع محتويات صفراء مائية ، في حين كان الأمعاء الدقيقة لمجموعة التحكم طبيعية (الشكل 4 ((أ)).كشف تحليل RT-qPCR أن عدد نسخ جين GETV nsP1 في الدم الذي تم جمعه بعد يومين من التحدي كان قريبًا من 106/mlفي حين لم يتم الكشف عن أي فيروس في المجموعة المقابلة (الشكل 4 ((د)).وأظهرت أنسجة الدماغ من الخنازير ارتفاع الحمل الفيروسي في جميع أعضاء المجموعة المصابة بـ HNzk- XH1، بينما لم يتم الكشف عن أي RNA GETV في المجموعة المراقبة (الشكل 4 ((إ))).

الشكل الرابع: المرض في الخنازير

(أ) العلامات السريرية ونتائج تشريح الجثث للخنازير المصابة. (ب) النتائج السريرية للخنازير المصابة.

(ج) معدل البقاء على قيد الحياة للخنازير المصابة. (د) مستويات RNA الفيروسية في الدم الكامل للخنازير المصابة في اليوم الثاني بعد العدوى.

(هـ) مستويات الحمض النووي الريبوزي الفيروسي في أعضاء مختلفة من الخنازير التي ماتت أو تم إعدامها بعد العدوى.

الاستنتاج: سلالة HNzk-XH1 مُسببة للمرض بشكل كبير للخنازير، مما يسبب بسرعة أعراض سريرية وخطورة وفيات. يوجد الفيروس على نطاق واسع في الدم والأعضاء الرئيسية.لم تلاحظ أي تشوهات في مجموعة المراقبة.

5التغيرات المرضية في الفئران المرضعة المصابة بالمتغير HNzk-XH1

تظهر هذه الدراسة أن الفئران التي ترضع هي نموذج مثالي لدراسة عدوى GETV.أظهرت النتائج التجريبية أن عدوى الفئران المرضعة بالمتغير HNzk-XH1 تسبب شلل الأطراف الخلفية وتأخير النمو (الشكل 5 ((أ))في المقابل، كانت سلالة HNZJ-S1 أقل فتكاً، والفئران المرضعة المصابة بجرعات منخفضة نجت وارتفعت في الوزن الطبيعي،مما يشير إلى وجود فرق كبير في المرضية للسلالات في الفئران في الرضاعة.

الشكل 5. مقارنة الجراثيم من HNzk-XH1 و HNZJ-S1

(أ) الأعراض السريرية للعدوى في الفئران المرضعة. (ب) معدل البقاء على قيد الحياة للفئران المرضعة المصابة بجرعات مختلفة من سلالة HNzk-XH1.

(ج) معدل البقاء على قيد الحياة للفئران الرضيعة المصابة بجرعات مختلفة من سلالة HNZJ-S1.

(هـ) تغيرات في الوزن للفئران المرضعة المصابة بجرعات مختلفة من سلالة HNZJ-S1.

الاستنتاج: أنّ الاختلاف HNzk-XH1 يُعتبر مُسبّباً بشكل كبير في الفئران التي ترضع، مما يسبب الشلل في الأطراف الخلفية، وتأخير النمو، والوفاة السريعة.والفئران التي تم إصابتها بالجرعات المنخفضة تبقى على قيد الحياة وتحافظ على وزن الجسم الطبيعي، مما يشير إلى اختلاف كبير في الفيروسية بين السلالتين.

الاستنتاج

تظهر هذه الدراسة أن تفشي فيروس التهاب الخنازير المكتسب في مزارع الخنازير في مقاطعة هنان من يوليو إلى سبتمبر 2024 تم تحديده على أنه متغير مستقل ومتفرع لمجموعة GIII ،يحتوي على أربعة طفرات حمض أميني فريدة في بروتينات E2 و nsP3بالمقارنة مع العيود السابقة، يظهر هذا التغير قوة فيروسية متزايدة وقد يكون قد تم نقله بهدوء من خلال الخنازير والبعوض قبل تفشي المرض.ظروف المناخ وأنماط تداول المزارع الخنازير تسارعت انتشار الوباءفي الوقت الحالي، لا يوجد لقاح متاح في الصين، مما يتطلب زيادة المراقبة وتعديلات في الوقت المناسب لاستراتيجيات الوقاية والسيطرة.