Le virus Geta (GETV) est un virus émergent transmis par les moustiques qui menace un large éventail d'animaux et d'humains.une épidémie concentrée de VETG s'est produite dans des élevages porcins de la province du Henan, marquant l'une des épidémies les plus répandues et les plus concentrées en Chine continentale ces dernières années.
De juillet à septembre 2024, une épidémie concentrée de Getavirus (GETV) s'est produite dans plusieurs élevages porcinaux de la province du Henan.dont 22 ont formé un groupe unique dans l'arbre phylogénétique et présenté des mutations d'acides aminés dans les protéines nsP3 et E2.
Des expériences ont démontré que cette variante GIII présentait une pathogénicité significativement accrue chez les porcelets, avec un taux de létalité de 100%, et présentait également une pathogénicité élevée chez la souris.Cette étude est la première enquête systématique sur une épidémie de VETG à grande échelle dans les élevages porcins du Henan, révélant une virulence et des caractéristiques moléculaires accrues de la variante GIII.
Introduction au projet
Le virus Geta (GETV) est un virus à ARN à un seul brin, à sens positif, qui infecte un large éventail d'animaux et peut même constituer une menace pour les humains.un foyer concentré de VETG s'est produit dans des élevages porcins commerciaux dans la province du HenanLa variante GIII était la souche pathogène prédominante, présentant une virulence accrue par rapport aux souches antérieures.Cette étude fournit une référence pour comprendre l'épidémiologie moléculaire et la pathogénicité du VETG.
Matériaux et méthodes
Cette étude a utilisé des cellules BHK-21 et PK-15 pour cultiver l'isolat porcin du GETV HNJZ-S1. L'acide nucléique viral a été extrait des élevages de porcs présumés infectés dans le Henan et le Shanxi, et l'ADNc a été synthétisé.La détection virale a été effectuée par PCR/RT-PCRDes échantillons positifs ont été isolés, purifiés et identifiés dans les cellules. Les caractéristiques de croissance virale et la formation de plaque ont été déterminées. Le gène E2 et l'ensemble du génome ont été amplifiés, clonés,et séquencé pour l'alignement des séquences et l'analyse phylogénétique.
Dans le cadre d'expériences sur des animaux, des porcelets GETV négatifs et des souris nourries au FPS âgées de deux jours ont reçu le virus par injection intramusculaire ou sous-cutanée.et les charges virales dans le sang et les tissus ont été mesurées. L'ARN viral a été extrait d'échantillons de tissus, l'ADNc a été synthétisé, puis détecté par le QPCR vert SYBR. Les données sont présentées en moyenne ± SD et analysées à l'aide du GraphPad Prism 9.0.
Résultats de la recherche
1. GETV Prélèvement d'échantillons et détection de virus
En juillet 2024, un foyer à forte mortalité s'est produit chez des porcelets âgés de 3 à 10 jours dans une ferme porcine de Zhumadian, dans la province du Henan, avec un taux de morbidité de 30% et un taux de mortalité de 80%.La confirmation en laboratoire indique que l'épidémie a été causée par une seule souche de VETGPar la suite, des épidémies présumées de VETG se sont produites dans des élevages de porcs de la province du Henan.La collecte clinique d'échantillons a révélé des foyers dans 12 des 18 villes de niveau préfectural et 21 des 157 comtés (figure 1 ((a))Les principaux symptômes chez les porcelets étaient une diarrhée sévère, une ataxie et une faiblesse des membres postérieurs.L' autopsie a révélé une lymphadénopathie hémorragique et enflammée., hémorragies pulmonaires, hémorragies superficielles dispersées et œdème sous-cutané (figure 1 ((b)). Sur les 36 échantillons positifs au VETG, seuls deux ont été co-infectés par le VCPD, le VCP2 ou le VJE;le reste a été infecté par un seul VETG (figure 1 ((c)).
Figure 1. Vue d'ensemble de l'épidémie de VETG dans les élevages porcins de la province du Henan
(a) Répartition des élevages porcins positifs au VETG dans la province du Henan. (b) Lésions histologiques brutes chez les porcelets infectés pendant cette épidémie.
(c) Identification par PCR du GETV et d'autres virus dans des échantillons de tissus.
Conclusion: l'infection par le VETG s'est produite chez des porcelets dans plusieurs fermes de la province du Henan, principalement causée par un seul virus.avec des infections mixtes dans quelques échantillons.
2. Isolement, identification et détermination du titre du GETV
Sur 36 échantillons positifs, 28 souches de VGE ont été isolées avec succès dans les cellules BHK-21. HNzk-XH1 et HNzmd-XP1 ont été identifiés comme VGE. Après 48 heures d'infection dans les cellules BHK-21 ou PK-15,changements cytopathiques importantsLa RT-PCR et la microscopie électronique ont également confirmé l'identité virale.Les courbes de prolifération ont montré que la cinétique de croissance des deux souches virales était similaireLes résultats de l'analyse de la plaque ont montré que les plaques des deux souches virales étaient de taille similaire, mais différentes en nombre.
Figure 2. Isolement et caractérisation du GETV
(A) Après infection des cellules BHK-21 et PK-15 par HNzk-XH1 ou HNzmd-XP1, des effets cytopathiques ont été observés dans les 12 à 36 heures.
(B) Des isolats de GETV ont été identifiés par RT-PCR. (C) La morphologie des particules de GETV a été examinée par microscopie électronique.
(d) Croissance de HNzk-XH1 ou HNzmd-XP1 dans les cellules BHK-21 et PK-15. (e) Morphologie de la plaque du GETV sur les cellules BHK-21.
Conclusion: les souches GETV HNzk-XH1 et HNzmd-XP1 ont été isolées avec succès à partir d'échantillons d'élevage porcin.avec une cinétique de croissance et des titres similaires, mais avec des différences dans le nombre de plaques.
3Séquencement et analyse phylogénétique
Les séquences génomiques entières (numéros d' adhésion de GenBank: PQ658739 PQ658750) et les séquences génétiques E2 (numéros d' adhésion de GenBank: PQ658751 PQ658766) obtenues dans le cadre de cette étude ont été soumises à GenBank.L' analyse homologique de l' ensemble du génome a montré que l' identité nucléotidique des isolats variait de 98 à 98L'identité nucléotidique de ces isolats avec GI, GII, GIV et GIII était de 94,8% 95,0% par rapport à la souche de référence. 96Les identités des acides aminés étaient respectivement de 98,5% à 98,8%, 98,9% à 99,1%, 98,3% à 99,5% et 98,7% à 100,0%.
L'analyse phylogénétique basée sur les gènes E2 de 28 isolats et de 12 génomes entiers a révélé que tous les isolats appartenaient à GIII, éloignés des autres groupes (Figure 3 ((a, b)).La plupart d'entre elles ont été regroupées avec la variante GDHYLC23 (figure 3 ((b))L'alignement des séquences d'acides aminés a révélé quatre mutations uniques dans les protéines nsP3 et E2 de ces isolats (figure 3 (c)).les mutations A381T et V503G sont situées dans la région HVD, et la protéine E2 a une mutation D323E à la position 323.
Figure 3. Analyse phylogénétique et alignement des séquences d'acides aminés des isolats. Analyse phylogénétique des isolats basée sur E2 (a) et génome complet (b).
Conclusion: les isolats de cette étude appartiennent tous au génotype GIII, éloignés des autres génotypes, et possèdent des mutations d'acides aminés uniques dans les protéines nsP3 et E2,confirmant que ces isolats sont des variantes GIII.
4. Pathogénicité de la souche GETV HNzk-XH1 chez les porcelets
En raison du taux de mortalité élevé des foyers de VETG dans les exploitations porcines commerciales et des titres élevés des virus VETG isolés à partir de cellules BHK-21 et PK-15,la souche HNzk-XH1 à titre plus élevé a été sélectionnée pour l'évaluation de la pathogénicité dans cette étudeLes porcelets du groupe de défi ont reçu par injection intramusculaire 107TCID50 de la souche HNzk-XH1, tandis que le groupe témoin a reçu un volume égal de DMEM.Vingt-quatre heures après le challenge, les porcelets du groupe de défi ont développé une diarrhée, suivie d'une paralysie des membres postérieurs 1,5 jours plus tard.atteignant un taux de mortalité de 100% (figure 4 (c))Les scores cliniques des symptômes ont montré que le groupe HNzk-XH1 présentait des symptômes significativement plus graves que le groupe témoin (figure 4 (b)).Pendant que le groupe témoin a été autopsié 8 jours plus tardLa paroi de l'intestin grêle du groupe HNzk-XH1 était significativement diluée, avec des contenus jaunes et aqueux, tandis que l'intestin grêle du groupe témoin était normal (figure 4 (a)).L'analyse RT-qPCR a révélé que le nombre de copies du gène GETV nsP1 dans le sang prélevé deux jours après le défi était proche de 106/ ml., alors qu'aucun virus n'a été détecté dans le groupe témoin (figure 4 ((d)).et les tissus cérébraux des porcelets ont révélé des charges virales élevées dans tous les organes du groupe infecté par HNzk-XH1., alors qu'aucun ARN GETV n'a été détecté dans le groupe témoin (figure 4 ((e)).
Figure 4. Pathogénicité chez les porcelets
a) Les signes cliniques et les résultats de l'autopsie des porcelets infectés. b) Les résultats cliniques des porcelets infectés.
(c) Taux de survie des porcelets infectés. (d) Niveaux d'ARN viral dans le sang entier des porcelets infectés le 2e jour après l'infection.
(e) Niveaux d'ARN viral dans différents organes de porcelets morts ou euthanasiés après infection.
Conclusion: la souche HNzk-XH1 est hautement pathogène pour les porcelets, provoquant rapidement des symptômes cliniques graves et la mortalité.Aucune anomalie n' a été observée dans le groupe témoin..
5Changements pathologiques chez les souris allaitantes infectées par la variante HNzk-XH1
Cette étude démontre que les souris allaitantes sont un modèle idéal pour étudier la virulence du VETG.Les résultats expérimentaux ont montré que l'infection de souris allaitantes par la variante HNzk-XH1 provoquait une paralysie des membres postérieurs et un retard de croissance (figure 5 ((a))En revanche, la souche HNZJ-S1 était moins mortelle, et les souris allaitantes infectées par de faibles doses ont survécu et ont pris un poids normal.indiquant qu'il y avait une différence significative dans la pathogénicité des deux souches chez les souris allaitantes.
Figure 5. Comparaison de la pathogénicité du HNzk-XH1 et du HNZJ-S1
a) Symptômes cliniques de l'infection chez les souris allaitantes. b) Taux de survie des souris allaitantes infectées par différentes doses de la souche HNzk-XH1.
(c) Taux de survie des souris allaitantes infectées par différentes doses de la souche HNZJ-S1. (d) Changements de poids des souris allaitantes infectées par différentes doses de la souche HNzk-XH1.
e) Changements de poids chez les souris allaitantes infectées par différentes doses de la souche HNZJ-S1.
Conclusion: la variante HNzk-XH1 est hautement pathogène chez les souris allaitantes, provoquant une paralysie des membres postérieurs, un retard de croissance et une mort rapide.et les souris allaitantes infectées par de faibles doses survivent et maintiennent un poids normal, indiquant une différence significative de virulence entre les deux souches.
Conclusion
La présente étude démontre que l'épidémie de VETG dans les élevages porcinaux de la province du Henan de juillet à septembre 2024 a été identifiée comme une variante indépendante et ramifiée du groupe GIII,contenant quatre mutations d'acides aminés uniques dans les protéines E2 et nsP3Comparé aux isolats antérieurs, cette variante présente une virulence accrue et a peut-être été discrètement transmise par les porcs et les moustiques avant l'épidémie.Les conditions climatiques et la circulation des porcs ont accéléré la propagation de l'épidémieActuellement, aucun vaccin n'est disponible en Chine, ce qui nécessite une surveillance renforcée et des ajustements opportuns des stratégies de prévention et de contrôle.
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