notícias da empresa sobre Compartilhamento da Pesquisa Mais Recente | Prevalência de Variantes do Getavírus GIII com Virulência Aumentada em Granjas de Suínos na Província de Henan

O vírus Geta (GETV) é um vírus emergente transmitido por mosquitos que ameaça uma ampla gama de animais e humanos.ocorreu um foco concentrado de VETG em explorações de suínos na província de Henan, marcando um dos surtos mais disseminados e concentrados na China continental nos últimos anos.

De julho a setembro de 2024, ocorreu um surto concentrado de vírus Geta (GETV) em várias fazendas de suínos na província de Henan. Vinte e sete estirpes foram isoladas de 31 fazendas de suínos,22 dos quais formaram um aglomerado único na árvore filogenética e apresentaram mutações de aminoácidos nas proteínas nsP3 e E2..

Os experimentos demonstraram que esta variante GIII exibia uma patogenicidade significativamente aumentada em leitões, com uma taxa de letalidade de 100%, e também exibia uma patogenicidade elevada em ratos.Este estudo é a primeira investigação sistemática de um surto de VETG em larga escala em explorações de suínos de Henan, revelando a virulência aumentada e as características moleculares da variante GIII.

Introdução

O vírus Geta (GETV) é um vírus RNA de cadeia única e sentido positivo que infecta uma ampla gama de animais e pode até representar uma ameaça para os seres humanos.ocorreu um foco concentrado de VETG em explorações comerciais de suínos na província de Henan, resultando no isolamento de 27 estirpes. A variante GIII foi a estirpe patogénica predominante, apresentando maior virulência em comparação com estirpes anteriores.Este estudo fornece uma referência para compreender a epidemiologia molecular e a patogenicidade do VETG.

Materiais e Métodos

Este estudo utilizou células BHK-21 e PK-15 para cultivar o isolado porcino do GETV HNJZ-S1. O ácido nucleico viral foi extraído de fazendas de suínos suspeitas de estarem infectadas em Henan e Shanxi, e cDNA foi sintetizado.A detecção do vírus foi realizada por PCR/RT-PCRAs amostras positivas foram isoladas, purificadas e identificadas em células. Características de crescimento viral e formação de placa foram determinadas. O gene E2 e o genoma inteiro foram amplificados, clonados,e sequenciado para alinhamento de sequências e análise filogenética.

Em experimentos com animais, foram injectados o vírus por via intramuscular ou subcutânea em leitões GETV negativos e ratos lactantes com FPS de dois dias de idade.e as cargas virais no sangue e nos tecidos foram medidasO RNA viral foi extraído de amostras de tecido, o cDNA foi sintetizado e depois detectado pelo SYBR Green qPCR. Os dados são apresentados como média ± SD e analisados usando o GraphPad Prism 9.0.

Resultados da investigação

1. GETV Colheita de amostras e detecção de vírus

Em julho de 2024, ocorreu um surto de alta mortalidade em leitões de 3 a 10 dias de idade em uma fazenda de suínos em Zhumadian, província de Henan, com uma taxa de morbidade de 30% e uma taxa de mortalidade de 80%.A confirmação laboratorial indicou que o surto foi causado por uma única estirpe do GETVPosteriormente, ocorreram supostos surtos de VETG em explorações de suínos na província de Henan.A recolha de amostras clínicas revelou surtos em 12 das 18 cidades de nível de prefeitura e 21 dos 157 condados (Figura 1 ((a))De julho a setembro, houve um, 15 e 16 surtos, respectivamente. Os principais sintomas nos leitões foram diarreia grave, ataxia e fraqueza dos membros traseiros.As autópsia revelaram linfadenopatia hemorrágica e inchada., hemorragias pulmonares, hemorragias superficiais dispersas e edema subcutâneo (Figura 1 ((b)). Das 36 amostras positivas para o GETV, apenas duas foram co-infectadas com PDCoV, PCV2 ou JEV;o restante foi infectado com um único VETG (Figura 1 ((c)).

Gráfico 1. Visão geral do surto de VETG nas explorações de suínos na província de Henan

(a) Distribuição das explorações de suínos positivos para o VETG na província de Henan. (b) Lesões histológicas brutas em leitões infectados durante este surto.

c) Identificação por PCR do GETV e de outros vírus em amostras de tecidos.

Conclusão: A infecção pelo GETV ocorreu em leitões de várias explorações na província de Henan, causada principalmente por um único vírus.com infecções mistas que ocorrem em algumas amostras.

2Isolamento, identificação e determinação do título do GETV

A partir de 36 amostras positivas, 28 estirpes de GETV foram isoladas com sucesso em células BHK-21. HNzk-XH1 e HNzmd-XP1 foram identificados como GETV. Após 48 horas de infecção em células BHK-21 ou PK-15, a infecção foi detectada em células BHK-21, HNzk-XH1 e HNzmd-XP1.alterações citopáticas significativasA RT-PCR e a microscopia eletrônica confirmaram ainda mais a identidade viral.As curvas de proliferação mostraram que a cinética de crescimento das duas estirpes do vírus era semelhanteOs resultados da análise da placa mostraram que as placas das duas estirpes do vírus eram semelhantes em tamanho, mas diferiram em número.

Figura 2. Isolamento e caracterização do GETV

(A) Após a infecção de células BHK-21 e PK-15 com HNzk- XH1 ou HNzmd- XP1, foram observados efeitos citopáticos no prazo de 12 a 36 horas.

(B) Os isolados de GETV foram identificados por RT-PCR. (C) A morfologia das partículas de GETV foi examinada por microscopia eletrônica.

d) Crescimento de HNzk-XH1 ou HNzmd-XP1 nas células BHK-21 e PK-15. e) Morfologia da placa de GETV nas células BHK-21.

Conclusão: As estirpes GETV HNzk-XH1 e HNzmd-XP1 foram isoladas com êxito a partir de amostras de explorações porcinas.com cinética de crescimento e variações de título similares, mas com diferenças no número de placas.

3Sequenciamento e Análise Filogenética

Foram submetidas ao GenBank as sequências do genoma inteiro (números de adesão do GenBank: PQ658739 PQ658750) e as sequências do gene E2 (números de adesão do GenBank: PQ658751 PQ658766) obtidas neste estudo.A análise de homologia do genoma inteiro mostrou que a identidade de nucleotídeos entre os isolados variava de 98Em comparação com a estirpe de referência, as identidades de nucleotídeos destes isolados com IG, GII, GIV e GIII foram de 94,8% – 95,0%, 96As identidades de aminoácidos foram de 98,5%-98,8%, 98,9%-99,1%, 98,3%-99,5% e 98,7%-100,0%, respectivamente.

A análise filogenética baseada nos genes E2 de 28 isolados e 12 genomas inteiros revelou que todos os isolados pertenciam ao GIII, distantemente relacionados com outros grupos (Figura 3 ((a, b)).A maioria deles agrupados com a variante GDHYLC23 (Figura 3 ((b))O alinhamento da sequência de aminoácidos revelou quatro mutações únicas nas proteínas nsP3 e E2 destes isolados (Figura 3 ((c)).As mutações A381T e V503G estão localizadas na região HVD, e a proteína E2 tem uma mutação D323E na posição 323.

Figura 3. Análise filogenética e alinhamento da sequência de aminoácidos de isolados. Análise filogenética de isolados com base em E2 (a) e genoma completo (b).

Conclusão: Os isolados deste estudo pertencem todos ao genótipo GIII, distantemente relacionados com outros genótipos, e possuem mutações únicas de aminoácidos nas proteínas nsP3 e E2,que confirmam que estes isolados são variantes GIII.

4Patogenicidade da estirpe GETV HNzk-XH1 em leitões

Devido à elevada taxa de mortalidade dos surtos de VETG em explorações porcinas comerciais e aos elevados títulos dos vírus VETG isolados a partir de células BHK-21 e PK-15,A estirpe HNzk-XH1 com título mais elevado foi seleccionada para avaliação da patogenicidade neste estudo.Os leitões do grupo de desafio foram injectados intramuscularmente com 107TCID50 da estirpe HNzk-XH1, enquanto o grupo de controlo foi injectado com um volume igual de DMEM.Vinte e quatro horas após o desafio, os leitões do grupo de desafio desenvolveram diarreia, seguida de paralisia dos membros traseiros 1,5 dias depois.atingindo uma taxa de mortalidade de 100% (Figura 4 (c))Os resultados dos sintomas clínicos mostraram que o grupo HNzk-XH1 apresentou sintomas significativamente mais graves do que o grupo de controlo (Figura 4 (b)).Enquanto o grupo de controlo foi autopsiado 8 dias depoisA parede do intestino delgado do grupo HNzk-XH1 foi significativamente diluída, com conteúdo amarelo e aquoso, enquanto o intestino delgado do grupo de controlo foi normal (Figura 4 (a)).A análise RT-qPCR revelou que o número de cópias do gene GETV nsP1 no sangue recolhido dois dias após o ensaio era próximo de 106/ ml., enquanto não foi detectado vírus no grupo de controlo (Figura 4 ((d)).e tecidos cerebrais dos leitões revelaram altas cargas virais em todos os órgãos do grupo infectado por HNzk-XH1., enquanto não foi detectado RNA GETV no grupo de controlo (Figura 4 ((e)).

Figura 4. Patogenicidade em leitões

(a) Sinais clínicos e resultados da autópsia de leitões infectados. (b) Resultados clínicos de leitões infectados.

(c) Taxa de sobrevivência dos leitões infectados. (d) Níveis de ARN viral no sangue integral dos leitões infectados no dia 2 após a infecção.

(e) Níveis de ARN viral em diferentes órgãos de leitões que morreram ou foram sacrificados após a infecção.

Conclusão: A estirpe HNzk-XH1 é altamente patogénica para leitões, causando rapidamente sintomas clínicos graves e mortalidade.Não foram observadas anomalias no grupo de controlo..

5Mudanças patológicas em ratos lactantes infectados com a variante HNzk-XH1

Este estudo demonstra que os ratos lactantes são um modelo ideal para estudar a virulência do GETV.Os resultados experimentais mostraram que a infecção de ratos lactentes com a variante HNzk-XH1 causou paralisia dos membros posteriores e atraso no crescimento (Figura 5 ((a))Em contraste, a cepa HNZJ-S1 foi menos letal, e ratos lactentes infectados com baixas doses sobreviveram e ganharam peso normal.indicando que houve uma diferença significativa na patogenicidade das duas estirpes em ratos em aleitamento.

Figura 5. Comparação da patogenicidade de HNzk-XH1 e HNZJ-S1

(a) Sintomas clínicos da infecção em ratos lactentes. (b) Taxa de sobrevivência de ratos lactentes infectados com diferentes doses da estirpe HNzk-XH1.

c) Taxa de sobrevivência de ratos lactantes infectados com diferentes doses da estirpe HNZJ-S1. d) Alterações de peso de ratos lactantes infectados com diferentes doses da estirpe HNzk-XH1.

e) Alterações de peso de ratos lactantes infectados com diferentes doses da estirpe HNZJ-S1.

Conclusão: A variante HNzk-XH1 é altamente patogénica em ratos lactentes, causando paralisia dos membros traseiros, atraso no crescimento e morte rápida.e ratos em aleitamento infectados com doses baixas sobrevivem e mantêm peso corporal normal, indicando uma diferença significativa na virulência entre as duas estirpes.

Conclusão

O presente estudo demonstra que o surto de VETG em explorações de suínos na província de Henan, de julho a setembro de 2024, foi identificado como uma variante independente e ramificada do grupo GIII,que abrigam quatro mutações únicas de aminoácidos nas proteínas E2 e nsP3Em comparação com os isolados anteriores, esta variante apresenta maior virulência e pode ter sido transmitida silenciosamente através de porcos e mosquitos antes do surto.As condições climáticas e os padrões de circulação das explorações de suínos aceleraram a propagação da epidemiaAtualmente, não há vacina disponível na China, exigindo vigilância reforçada e ajustes oportunos às estratégias de prevenção e controle.