Geta virus (GETV) is een opkomend door muggen overgedragen virus dat een breed scala aan dieren en mensen bedreigt. Van juli tot september 2024 vond er een geconcentreerde uitbraak van GETV plaats op varkensbedrijven in de provincie Henan, wat een van de meest wijdverspreide en geconcentreerde uitbraken in het vasteland van China in de afgelopen jaren markeert.
Van juli tot september 2024 vond er een geconcentreerde uitbraak van Geta virus (GETV) plaats op meerdere varkensbedrijven in de provincie Henan. Zevenentwintig stammen werden geïsoleerd van 31 varkensbedrijven, waarvan 22 een unieke cluster vormden in de fylogenetische boom en aminozuurmutaties vertoonden in de nsP3- en E2-eiwitten.
Experimenten toonden aan dat deze GIII-variant significant verhoogde pathogeniteit vertoonde bij biggen, met een sterftecijfer van 100%, en ook een hoge pathogeniteit vertoonde bij muizen. Deze studie is het eerste systematische onderzoek naar een grootschalige GETV-uitbraak op varkensbedrijven in Henan, waarbij de verhoogde virulentie en moleculaire kenmerken van de GIII-variant werden onthuld.
Inleiding
Geta virus (GETV) is een enkelstrengs, positief-sense RNA-virus dat een breed scala aan dieren infecteert en zelfs een bedreiging kan vormen voor mensen. Van juli tot september 2024 vond er een geconcentreerde uitbraak van GETV plaats op commerciële varkensbedrijven in de provincie Henan, wat resulteerde in de isolatie van 27 stammen. De GIII-variant was de overheersende pathogene stam en vertoonde een verhoogde virulentie in vergelijking met eerdere stammen. Deze studie biedt een referentie voor het begrijpen van de moleculaire epidemiologie en pathogeniteit van GETV.
Materialen en methoden
Deze studie gebruikte BHK-21- en PK-15-cellen om het porcine GETV-isolaat HNJZ-S1 te cultiveren. Viraal nucleïnezuur werd geëxtraheerd uit verdachte geïnfecteerde varkensbedrijven in Henan en Shanxi, en cDNA werd gesynthetiseerd. Virale detectie werd uitgevoerd door middel van PCR/RT-PCR. Positieve monsters werden geïsoleerd, gezuiverd en geïdentificeerd in cellen. De virale groeikenmerken en plaquevorming werden bepaald. Het E2-gen en het hele genoom werden geamplificeerd, gekloneerd en gesequenced voor sequentie-uitlijning en fylogenetische analyse.
In dierproeven werden GETV-negatieve biggen en twee dagen oude SPF-zuigelingenmuizen intramusculair of subcutaan geïnjecteerd met het virus. Klinische symptomen of sterfte werden waargenomen en virale ladingen in bloed en weefsels werden gemeten. Viraal RNA werd geëxtraheerd uit weefselmonsters, cDNA werd gesynthetiseerd en vervolgens gedetecteerd door SYBR Green qPCR. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD en geanalyseerd met behulp van GraphPad Prism 9.0.
Onderzoeksresultaten
1. GETV-monstercollectie en virusdetectie
In juli 2024 vond er een uitbraak met hoge sterfte plaats bij 3 tot 10 dagen oude biggen op een varkensbedrijf in Zhumadian, provincie Henan, met een morbiditeitspercentage van 30% en een sterftecijfer van 80%. Laboratoriumbevestiging wees uit dat de uitbraak werd veroorzaakt door een enkele GETV-stam. Vervolgens deden zich verdachte GETV-uitbraken voor op varkensbedrijven in de provincie Henan. Klinische monsterneming onthulde uitbraken in 12 van de 18 steden op prefectuurniveau en 21 van de 157 districten (Figuur 1(a)). Van juli tot september waren er respectievelijk één, 15 en 16 uitbraken. De belangrijkste symptomen bij biggen waren ernstige diarree, ataxie en zwakte van de achterpoten. Autopsies onthulden gezwollen en hemorragische lymfadenopathie, longbloedingen, verspreide oppervlakkige bloedingen en subcutaan oedeem (Figuur 1(b)). Van de 36 GETV-positieve monsters waren er slechts twee co-geïnfecteerd met PDCoV, PCV2 of JEV; de rest was geïnfecteerd met een enkele GETV (Figuur 1(c)).
Figuur 1. Overzicht van de GETV-uitbraak op varkensbedrijven in de provincie Henan
(a) Verdeling van GETV-positieve varkensbedrijven in de provincie Henan. (b) Bruto histologische laesies bij geïnfecteerde biggen tijdens deze uitbraak.
(c) PCR-identificatie van GETV en andere virussen in weefselmonsters.
Conclusie: GETV-infectie trad op bij biggen op meerdere bedrijven in de provincie Henan, voornamelijk veroorzaakt door een enkel virus. Klinische manifestaties waren onder meer diarree, ataxie en zwakte van de achterpoten, waarbij gemengde infecties in een paar monsters voorkwamen.
2. Isolatie, identificatie en titerbepaling van GETV
Van 36 positieve monsters werden 28 GETV-stammen succesvol geïsoleerd in BHK-21-cellen. HNzk-XH1 en HNzmd-XP1 werden geïdentificeerd als GETV. Na 48 uur infectie in BHK-21- of PK-15-cellen werden significante cytopathische veranderingen waargenomen, waaronder celkrimp, afgeronding en exfoliatie, in vergelijking met controles. RT-PCR en elektronenmicroscopie bevestigden verder de virale identiteit. De proliferatiecurves toonden aan dat de groeikinetiek van de twee virusstammen vergelijkbaar was, met titers die een piek bereikten 36 uur na infectie en vervolgens afnamen. Plaque-assayresultaten toonden aan dat de plaques van de twee virusstammen qua grootte vergelijkbaar waren, maar verschilden in aantal.
Figuur 2. Isolatie en karakterisering van GETV
(A) Na infectie van BHK-21- en PK-15-cellen met HNzk-XH1 of HNzmd-XP1 werden cytopathische effecten waargenomen binnen 12 tot 36 uur.
(B) GETV-isolaten werden geïdentificeerd door RT-PCR. (C) De morfologie van GETV-deeltjes werd onderzocht door elektronenmicroscopie.
(d) Groei van HNzk-XH1 of HNzmd-XP1 in BHK-21- en PK-15-cellen. (e) Plaquemorfologie van GETV op BHK-21-cellen.
Conclusie: GETV-stammen HNzk-XH1 en HNzmd-XP1 werden succesvol geïsoleerd uit monsters van varkensbedrijven. Beide stammen veroorzaakten significante cytopathische effecten in cellen, met vergelijkbare groeikinetiek en titer variaties, maar met verschillen in het aantal plaques.
3. Sequencing en fylogenetische analyse
De volledige genoomsequenties (GenBank-toegangsnummers: PQ658739–PQ658750) en E2-gensequenties (GenBank-toegangsnummers: PQ658751–PQ658766) verkregen in deze studie zijn ingediend bij GenBank. Homologieanalyse van het volledige genoom toonde aan dat de nucleotide-identiteit tussen de isolaten varieerde van 98,4% tot 100,0%, en de aminozuuridentiteit varieerde van 99,3% tot 100,0%. Vergeleken met de referentiestam waren de nucleotide-identiteiten van deze isolaten met GI, GII, GIV en GIII respectievelijk 94,8%–95,0%, 96,9%–97,0%, 95,6%–97,3% en 96,9%–99,8%. De aminozuuridentiteiten waren respectievelijk 98,5%–98,8%, 98,9%–99,1%, 98,3%–99,5% en 98,7%–100,0%.
Fylogenetische analyse op basis van de E2-genen van 28 isolaten en 12 volledige genomen onthulde dat alle isolaten tot GIII behoorden, op afstand verwant aan andere groepen (Figuur 3(a,b)). De meeste van hen clusterden met de GDHYLC23-variant (Figuur 3(b)). Aminozuursequentie-uitlijning onthulde vier unieke mutaties in de nsP3- en E2-eiwitten van deze isolaten (Figuur 3(c)). De nsP3 P329S-mutatie bevindt zich in de ZBD-regio, de A381T- en V503G-mutaties bevinden zich in de HVD-regio en het E2-eiwit heeft een D323E-mutatie op positie 323. Op basis van deze kenmerken werden de isolaten in deze clade geïdentificeerd als GIII-varianten.
Figuur 3. Fylogenetische analyse en aminozuursequentie-uitlijning van isolaten. Fylogenetische analyse van isolaten op basis van E2 (a) en volledig genoom (b).
Conclusie: De isolaten in deze studie behoren allemaal tot het GIII-genotype, op afstand verwant aan andere genotypen, en bezitten unieke aminozuurmutaties in de nsP3- en E2-eiwitten, wat bevestigt dat deze isolaten GIII-varianten zijn.
4. Pathogeniteit van GETV HNzk-XH1-stam bij biggen
Vanwege het hoge sterftecijfer van GETV-uitbraken op commerciële varkensbedrijven en de hoge titers van GETV-virussen geïsoleerd uit BHK-21- en PK-15-cellen, werd de hogere-titer HNzk-XH1-stam geselecteerd voor pathogeniteitsevaluatie in deze studie. Biggen in de challengegroep werden intramusculair geïnjecteerd met 10⁷TCID₅₀ van de HNzk-XH1-stam, terwijl de controlegroep werd geïnjecteerd met een gelijk volume DMEM-medium. Vierentwintig uur na de challenge ontwikkelden biggen in de challengegroep diarree, gevolgd door verlamming van de achterpoten 1,5 dagen later. Twee dagen later stierven sommige biggen en binnen vier dagen waren alle biggen gestorven, met een sterftecijfer van 100% (Figuur 4(c)). Klinische symptoomscores toonden aan dat de HNzk-XH1-groep significant ernstigere symptomen had dan de controlegroep (Figuur 4(b)). Dode biggen werden onmiddellijk geautopsieerd, terwijl de controlegroep 8 dagen later werd geautopsieerd. De dunne darmwand van de HNzk-XH1-groep was significant dunner, met gele, waterige inhoud, terwijl de dunne darm van de controlegroep normaal was (Figuur 4(a)). RT-qPCR-analyse onthulde dat het GETV nsP1-genkopieaantal in bloed dat twee dagen na de challenge werd verzameld, dicht bij 10⁶/ml lag, terwijl er geen virus werd gedetecteerd in de controlegroep (Figuur 4(d)). Onderzoek van de lever-, long-, nier-, milt-, dunne darm- en hersenweefsels van de biggen onthulde hoge virale ladingen in alle organen van de HNzk-XH1-geïnfecteerde groep, terwijl er geen GETV RNA werd gedetecteerd in de controlegroep (Figuur 4(e)).
Figuur 4. Pathogeniteit bij biggen
(a) Klinische tekenen en autopsieresultaten van geïnfecteerde biggen. (b) Klinische scores van geïnfecteerde biggen.
(c) Overlevingspercentage van geïnfecteerde biggen. (d) Virale RNA-niveaus in volbloed van geïnfecteerde biggen op dag 2 na infectie.
(e) Virale RNA-niveaus in verschillende organen van biggen die stierven of werden geëuthanaseerd na infectie.
Conclusie: De HNzk-XH1-stam is zeer pathogeen voor biggen en veroorzaakt snel ernstige klinische symptomen en sterfte. Het virus is wijdverspreid aanwezig in het bloed en de belangrijkste organen. Er werden geen afwijkingen waargenomen in de controlegroep.
5. Pathologische veranderingen bij zuigelingenmuizen geïnfecteerd met de HNzk-XH1-variant
Deze studie toont aan dat zuigelingenmuizen een ideaal model zijn voor het bestuderen van de virulentie van GETV. De experimentele resultaten toonden aan dat infectie van zuigelingenmuizen met de HNzk-XH1-variant verlamming van de achterpoten en groeivertraging veroorzaakte (Figuur 5(a)), en leidde tot snelle dood bij verschillende doses. In tegenstelling hiermee was de HNZJ-S1-stam minder dodelijk en overleefden zuigelingenmuizen die met lage doses waren geïnfecteerd en namen ze normaal gewicht toe, wat aangeeft dat er een significant verschil was in de pathogeniteit van de twee stammen bij zuigelingenmuizen.
Figuur 5. Vergelijking van pathogeniteit van HNzk-XH1 en HNZJ-S1
(a) Klinische symptomen van infectie bij zuigelingenmuizen. (b) Overlevingspercentage van zuigelingenmuizen geïnfecteerd met verschillende doses van de HNzk-XH1-stam.
(c) Overlevingspercentage van zuigelingenmuizen geïnfecteerd met verschillende doses van de HNZJ-S1-stam. (d) Gewichtsveranderingen van zuigelingenmuizen geïnfecteerd met verschillende doses van de HNzk-XH1-stam.
(e) Gewichtsveranderingen van zuigelingenmuizen geïnfecteerd met verschillende doses van de HNZJ-S1-stam.
Conclusie: De HNzk-XH1-variant is zeer pathogeen bij zuigelingenmuizen en veroorzaakt verlamming van de achterpoten, groeivertraging en snelle dood. De HNZJ-S1-stam is minder pathogeen en zuigelingenmuizen die met lage doses zijn geïnfecteerd, overleven en behouden een normaal lichaamsgewicht, wat wijst op een significant verschil in virulentie tussen de twee stammen.
Conclusie
Deze studie toont aan dat de GETV-uitbraak op varkensbedrijven in de provincie Henan van juli tot september 2024 werd geïdentificeerd als een onafhankelijke, vertakkende variant van de GIII-groep, met vier unieke aminozuurmutaties in de E2- en nsP3-eiwitten. In vergelijking met eerdere isolaten vertoont deze variant een verhoogde virulentie en kan deze stilletjes zijn overgedragen via varkens en muggen vóór de uitbraak. Klimaatcondities en circulatiepatronen op varkensbedrijven versnelden de verspreiding van de epidemie. Momenteel is er geen vaccin beschikbaar in China, wat een verbeterde surveillance en tijdige aanpassingen van preventie- en bestrijdingsstrategieën noodzakelijk maakt.
Uw bericht moet tussen de 20-3.000 tekens bevatten!