El virus Geta (GETV) es un virus emergente transmitido por mosquitos que amenaza a una amplia gama de animales y humanos.se ha producido un brote concentrado de VETG en granjas porcinas de la provincia de Henan, marcando uno de los brotes más extendidos y concentrados en China continental en los últimos años.
De julio a septiembre de 2024, se produjo un brote concentrado de virus Geta (GETV) en múltiples granjas porcinas en la provincia de Henan. Se aislaron veintisiete cepas de 31 granjas porcinas,22 de los cuales formaron un grupo único en el árbol filogenético y presentaron mutaciones de aminoácidos en las proteínas nsP3 y E2..
Los experimentos demostraron que esta variante GIII presentaba una patogenicidad significativamente mayor en lechones, con una tasa de letalidad del 100%, y también una patogenicidad elevada en ratones.Este estudio es la primera investigación sistemática de un brote de VETG a gran escala en granjas porcinas de Henan, revelando la mayor virulencia y características moleculares de la variante GIII.
Introducción
El virus Geta (GETV) es un virus de ARN de cadena única y sentido positivo que infecta a una amplia gama de animales e incluso puede representar una amenaza para los seres humanos.se ha producido un brote concentrado de VETG en granjas porcinas comerciales en la provincia de HenanLa variante GIII fue la cepa patógena predominante, mostrando una mayor virulencia en comparación con las cepas anteriores.Este estudio proporciona una referencia para comprender la epidemiología molecular y la patogenicidad del VETG.
Materiales y métodos
Este estudio utilizó células BHK-21 y PK-15 para cultivar el aislado porcino de GETV HNJZ-S1. Se extrajo ácido nucleico viral de granjas de cerdos sospechosos de estar infectados en Henan y Shanxi, y se sintetizó ADNc.La detección del virus se realizó mediante PCR/RT-PCRLas muestras positivas fueron aisladas, purificadas e identificadas en las células. Se determinaron las características de crecimiento viral y la formación de placa. El gen E2 y todo el genoma fueron amplificados, clonados,y secuenciado para la alineación de secuencias y análisis filogenético.
En experimentos con animales, se inyectó el virus por vía intramuscular o subcutánea en lechones con GETV negativo y ratones lactantes con FPS de dos días de edad.y se midieron las cargas virales en sangre y tejidosSe extrajo ARN viral de muestras de tejido, se sintetizó ADNc y luego se detectó por SYBR Green qPCR. Los datos se presentan como medios ± SD y se analizan utilizando GraphPad Prism 9.0.
Resultados de la investigación
1GETV Recogida de muestras y detección de virus
En julio de 2024, se produjo un brote de alta mortalidad en lechones de 3 a 10 días de edad en una granja de cerdos en Zhumadian, provincia de Henan, con una tasa de morbilidad del 30% y una tasa de mortalidad del 80%.La confirmación de laboratorio indicó que el brote fue causado por una sola cepa de GETVPosteriormente, se produjeron brotes sospechosos de VETG en granjas porcinas de toda la provincia de Henan.La recogida de muestras clínicas reveló brotes en 12 de las 18 ciudades de nivel prefectural y 21 de los 157 condados (gráfico 1 ((a))Desde julio hasta septiembre, hubo uno, 15 y 16 brotes, respectivamente. Los síntomas principales en los lechones fueron diarrea severa, ataxia y debilidad de las extremidades traseras.Las autopsias revelaron una linfadenopatía hinchada y hemorrágica., hemorragias pulmonares, hemorragias superficiales dispersas y edema subcutáneo (Figura 1 ((b)). De las 36 muestras con GETV positivo, solo dos fueron coinfectadas con PDCoV, PCV2 o JEV;el resto fue infectado con un único VETG (Figura 1 ((c)).
Figura 1. Resumen del brote de VETG en las granjas porcinas de la provincia de Henan
(a) Distribución de las granjas porcinas con VETG positivo en la provincia de Henan. (b) Lesiones histológicas brutas en lechones infectados durante este brote.
c) Identificación por PCR del VETG y otros virus en muestras de tejido.
Conclusión: La infección por VETG se produjo en lechones de varias granjas de la provincia de Henan, causada principalmente por un solo virus.con infecciones mixtas que ocurren en pocas muestras.
2. Aislamiento, identificación y determinación del título de GETV
A partir de 36 muestras positivas, 28 cepas de GETV se aislaron con éxito en células BHK-21. HNzk-XH1 y HNzmd-XP1 se identificaron como GETV. Después de 48 horas de infección en células BHK-21 o PK-15, se detectó que la infección se produjo en las células BHK-21, HNzk-XH1 y HNzmd-XP1.cambios citopáticos significativosLa RT-PCR y la microscopía electrónica confirmaron además la identidad viral.Las curvas de proliferación mostraron que la cinética de crecimiento de las dos cepas de virus eran similaresLos resultados del análisis de placas mostraron que las placas de las dos cepas del virus eran similares en tamaño, pero diferían en número.
Figura 2. Aislamiento y caracterización de GETV
(A) Después de la infección de las células BHK-21 y PK-15 con HNzk-XH1 o HNzmd-XP1, se observaron efectos citopáticos dentro de las 12 a 36 horas.
(B) Los aislados de GETV se identificaron mediante RT-PCR. (C) La morfología de las partículas de GETV se examinó mediante microscopía electrónica.
d) Crecimiento de HNzk-XH1 o HNzmd-XP1 en las células BHK-21 y PK-15. e) Morfología de la placa de GETV en las células BHK-21.
Conclusión: las cepas de GETV HNzk-XH1 y HNzmd-XP1 se aislaron con éxito de muestras de granjas porcinas.con una cinética de crecimiento y variaciones de título similares, pero con diferencias en el número de placas.
3Secuenciación y análisis filogenético
Se han presentado a GenBank las secuencias de genoma completo (números de acceso a GenBank: PQ658739 PQ658750) y las secuencias de genes E2 (números de acceso a GenBank: PQ658751 PQ658766) obtenidas en este estudio.El análisis de homología de todo el genoma mostró que la identidad de nucleótidos entre los aislados osciló entre 98En comparación con la cepa de referencia, las identidades de nucleótidos de estos aislados con IG, GII, GIV y GIII fueron del 94,8% al 95,0%. 96Las identidades de aminoácidos fueron 98,5% 98,8%, 98,9% 99,1%, 98,3% 99,5% y 98,7% 100,0%, respectivamente.
El análisis filogenético basado en los genes E2 de 28 aislados y 12 genomas completos reveló que todos los aislados pertenecían a GIII, distantemente relacionados con otros grupos (Figura 3 ((a, b)).La mayoría de ellos se agruparon con la variante GDHYLC23 (Figura 3 ((b))La alineación de la secuencia de aminoácidos reveló cuatro mutaciones únicas en las proteínas nsP3 y E2 de estos aislados (Figura 3 ((c)).las mutaciones A381T y V503G se encuentran en la región HVD, y la proteína E2 tiene una mutación D323E en la posición 323.
Figura 3. Análisis filogenético y alineación de la secuencia de aminoácidos de los aislados. Análisis filogenético de los aislados basado en E2 (a) y el genoma completo (b).
Conclusión: Los aislados en este estudio pertenecen todos al genotipo GIII, distantemente relacionados con otros genotipos, y poseen mutaciones de aminoácidos únicas en las proteínas nsP3 y E2,que confirma que estos aislados son variantes GIII.
4Patogenicidad de la cepa GETV HNzk-XH1 en lechones
Debido a la elevada tasa de mortalidad de los brotes de VETG en las granjas porcinas comerciales y a los altos títulos de los virus VETG aislados de las células BHK-21 y PK-15,en este estudio se seleccionó la cepa HNzk-XH1 con mayor título para la evaluación de la patogenicidadLos lechones del grupo de prueba recibieron una inyección intramuscular de 107TCID50 de la cepa HNzk-XH1, mientras que el grupo control recibió una inyección de DMEM de igual volumen.Veinticuatro horas después del desafío, los lechones en el grupo de desafío desarrollaron diarrea, seguida de parálisis de las extremidades traseras 1,5 días después.Alcanzando una tasa de mortalidad del 100% (Figura 4 (c))Las puntuaciones de los síntomas clínicos mostraron que el grupo HNzk-XH1 tenía síntomas significativamente más graves que el grupo control (Figura 4 ((b)).Mientras que el grupo de control fue autopsiado 8 días despuésLa pared del intestino delgado del grupo HNzk-XH1 se diluyó significativamente, con un contenido amarillo y acuoso, mientras que el intestino delgado del grupo control fue normal (Figura 4 (a)).El análisis RT-qPCR reveló que el número de copias del gen GETV nsP1 en sangre recogida dos días después del desafío era cercano a 106/ ml., mientras que no se detectó virus en el grupo control (Figura 4 ((d)).y tejidos cerebrales de los lechones mostraron altas cargas virales en todos los órganos del grupo infectado con HNzk-XH1., mientras que no se detectó ningún ARN GETV en el grupo de control (Figura 4 (e)).
Figura 4. Patogenicidad en lechones
(a) Signos clínicos y resultados de la autopsia de lechones infectados. (b) Resultados clínicos de lechones infectados.
(c) Tasa de supervivencia de los lechones infectados. (d) Nivel de ARN viral en la sangre entera de los lechones infectados al segundo día después de la infección.
e) Los niveles de ARN viral en diferentes órganos de lechones que murieron o fueron sacrificados después de la infección.
Conclusión: La cepa HNzk-XH1 es altamente patógena para los lechones, causando rápidamente síntomas clínicos graves y mortalidad.No se observaron anomalías en el grupo control..
5Cambios patológicos en ratones lactantes infectados con la variante HNzk-XH1
Este estudio demuestra que los ratones lactantes son un modelo ideal para estudiar la virulencia de la GETV.Los resultados experimentales mostraron que la infección de ratones lactantes con la variante HNzk-XH1 causó parálisis de las extremidades traseras y retraso en el crecimiento (Figura 5 ((a))En contraste, la cepa HNZJ-S1 fue menos letal, y los ratones lactantes infectados con dosis bajas sobrevivieron y ganaron peso normal.indicando que hubo una diferencia significativa en la patogenicidad de las dos cepas en ratones lactantes.
Figura 5. Comparación de la patogenicidad de HNzk-XH1 y HNZJ-S1
(a) Síntomas clínicos de infección en ratones lactantes. (b) Tasa de supervivencia de ratones lactantes infectados con diferentes dosis de la cepa HNzk-XH1.
c) Tasa de supervivencia de ratones lactantes infectados con diferentes dosis de la cepa HNZJ-S1. d) Cambios de peso de ratones lactantes infectados con diferentes dosis de la cepa HNzk-XH1.
e) Cambios de peso de ratones lactantes infectados con diferentes dosis de la cepa HNZJ-S1.
Conclusión: La variante HNzk-XH1 es altamente patógena en ratones lactantes, causando parálisis de las extremidades traseras, retraso en el crecimiento y muerte rápida.y ratones lactantes infectados con dosis bajas sobreviven y mantienen un peso corporal normal, lo que indica una diferencia significativa en la virulencia entre las dos cepas.
Conclusión
El presente estudio demuestra que el brote de VETG en las granjas porcinas de la provincia de Henan entre julio y septiembre de 2024 se identificó como una variante independiente y ramificada del grupo GIII,que albergan cuatro mutaciones de aminoácidos únicos en las proteínas E2 y nsP3En comparación con los aislados anteriores, esta variante muestra una mayor virulencia y puede haberse transmitido silenciosamente a través de cerdos y mosquitos antes del brote.Las condiciones climáticas y los patrones de circulación de las granjas porcinas aceleraron la propagación de la epidemiaActualmente, no hay vacuna disponible en China, lo que requiere una mayor vigilancia y ajustes oportunos en las estrategias de prevención y control.
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