notizie sull'azienda Scambio di ultime ricerche. Prevalenza delle varianti Getavirus GIII con virulenza aumentata nelle fattorie suine nella provincia di Henan.

Il virus Geta (GETV) è un virus emergente trasmesso dalle zanzare che minaccia un'ampia gamma di animali e umani. Da luglio a settembre 2024, si è verificato un focolaio concentrato di GETV negli allevamenti suini della provincia di Henan, che ha segnato uno dei focolai più diffusi e concentrati nella Cina continentale negli ultimi anni.

Da luglio a settembre 2024, si è verificato un focolaio concentrato di virus Geta (GETV) in diversi allevamenti suini nella provincia di Henan. Sono stati isolati ventisette ceppi da 31 allevamenti suini, 22 dei quali hanno formato un cluster unico nell'albero filogenetico e hanno mostrato mutazioni degli amminoacidi nelle proteine nsP3 ed E2.

Gli esperimenti hanno dimostrato che questa variante GIII ha mostrato una patogenicità significativamente aumentata nei suinetti, con un tasso di letalità del 100%, e ha anche mostrato un'elevata patogenicità nei topi. Questo studio è la prima indagine sistematica su un focolaio di GETV su larga scala negli allevamenti suini di Henan, che rivela la maggiore virulenza e le caratteristiche molecolari della variante GIII.

Introduzione

Il virus Geta (GETV) è un virus a RNA a singolo filamento a senso positivo che infetta un'ampia gamma di animali e può persino rappresentare una minaccia per gli esseri umani. Da luglio a settembre 2024, si è verificato un focolaio concentrato di GETV negli allevamenti suini commerciali nella provincia di Henan, con conseguente isolamento di 27 ceppi. La variante GIII è stata il ceppo patogeno predominante, che ha mostrato una maggiore virulenza rispetto ai ceppi precedenti. Questo studio fornisce un riferimento per la comprensione dell'epidemiologia molecolare e della patogenicità di GETV.

Materiali e metodi

Questo studio ha utilizzato cellule BHK-21 e PK-15 per coltivare l'isolato di GETV suino HNJZ-S1. L'acido nucleico virale è stato estratto da allevamenti suini sospetti infetti a Henan e Shanxi e il cDNA è stato sintetizzato. Il rilevamento virale è stato eseguito mediante PCR/RT-PCR. I campioni positivi sono stati isolati, purificati e identificati nelle cellule. Sono state determinate le caratteristiche di crescita virale e la formazione di placche. Il gene E2 e l'intero genoma sono stati amplificati, clonati e sequenziati per l'allineamento della sequenza e l'analisi filogenetica.

Negli esperimenti sugli animali, i suinetti negativi al GETV e i topi lattanti SPF di due giorni sono stati iniettati per via intramuscolare o sottocutanea con il virus. Sono stati osservati segni clinici o mortalità e sono stati misurati i carichi virali nel sangue e nei tessuti. L'RNA virale è stato estratto da campioni di tessuto, il cDNA è stato sintetizzato e quindi rilevato mediante qPCR SYBR Green. I dati sono presentati come media ± DS e analizzati utilizzando GraphPad Prism 9.0.

Risultati della ricerca

1. Raccolta di campioni di GETV e rilevamento del virus

Nel luglio 2024, si è verificato un focolaio ad alta mortalità in suinetti di età compresa tra 3 e 10 giorni in un allevamento suino a Zhumadian, nella provincia di Henan, con un tasso di morbilità del 30% e un tasso di mortalità dell'80%. La conferma di laboratorio ha indicato che il focolaio era causato da un singolo ceppo di GETV. Successivamente, si sono verificati focolai sospetti di GETV negli allevamenti suini in tutta la provincia di Henan. La raccolta di campioni clinici ha rivelato focolai in 12 delle 18 città a livello di prefettura e in 21 delle 157 contee (Figura 1(a)). Da luglio a settembre, ci sono stati rispettivamente uno, 15 e 16 focolai. I sintomi principali nei suinetti erano diarrea grave, atassia e debolezza degli arti posteriori. Le autopsie hanno rivelato linfoadenopatia gonfia ed emorragica, emorragie polmonari, emorragie superficiali sparse ed edema sottocutaneo (Figura 1(b)). Dei 36 campioni positivi al GETV, solo due sono stati co-infettati con PDCoV, PCV2 o JEV; i restanti sono stati infettati con un singolo GETV (Figura 1(c)).

Figura 1. Panoramica del focolaio di GETV negli allevamenti suini nella provincia di Henan

(a) Distribuzione degli allevamenti suini positivi al GETV nella provincia di Henan. (b) Lesioni istologiche macroscopiche nei suinetti infetti durante questo focolaio.

(c) Identificazione PCR di GETV e altri virus nei campioni di tessuto.

Conclusione: l'infezione da GETV si è verificata nei suinetti in più allevamenti nella provincia di Henan, principalmente causata da un singolo virus. Le manifestazioni cliniche includevano diarrea, atassia e debolezza degli arti posteriori, con infezioni miste che si verificavano in pochi campioni.

2. Isolamento, identificazione e determinazione del titolo di GETV

Da 36 campioni positivi, sono stati isolati con successo 28 ceppi di GETV nelle cellule BHK-21. HNzk-XH1 e HNzmd-XP1 sono stati identificati come GETV. Dopo 48 ore di infezione nelle cellule BHK-21 o PK-15, sono state osservate significative alterazioni citopatiche, tra cui restringimento cellulare, arrotondamento ed esfoliazione, rispetto ai controlli. RT-PCR e microscopia elettronica hanno ulteriormente confermato l'identità virale. Le curve di proliferazione hanno mostrato che la cinetica di crescita dei due ceppi virali era simile, con titoli che raggiungevano un picco a 36 ore dopo l'infezione e poi diminuivano. I risultati del saggio di placca hanno mostrato che le placche dei due ceppi virali erano simili per dimensioni, ma differivano per numero.

Figura 2. Isolamento e caratterizzazione di GETV

(A) Dopo l'infezione delle cellule BHK-21 e PK-15 con HNzk-XH1 o HNzmd-XP1, gli effetti citopatici sono stati osservati entro 12-36 ore.

(B) Gli isolati di GETV sono stati identificati mediante RT-PCR. (C) La morfologia delle particelle di GETV è stata esaminata mediante microscopia elettronica.

(d) Crescita di HNzk-XH1 o HNzmd-XP1 nelle cellule BHK-21 e PK-15. (e) Morfologia delle placche di GETV sulle cellule BHK-21.

Conclusione: i ceppi di GETV HNzk-XH1 e HNzmd-XP1 sono stati isolati con successo da campioni di allevamenti suini. Entrambi i ceppi hanno causato significativi effetti citopatici nelle cellule, con cinetiche di crescita e variazioni di titolo simili, ma con differenze nel numero di placche.

3. Sequenziamento e analisi filogenetica

Le sequenze dell'intero genoma (numeri di accesso GenBank: PQ658739–PQ658750) e le sequenze del gene E2 (numeri di accesso GenBank: PQ658751–PQ658766) ottenute in questo studio sono state inviate a GenBank. L'analisi di omologia dell'intero genoma ha mostrato che l'identità nucleotidica tra gli isolati variava dal 98,4% al 100,0% e l'identità amminoacidica variava dal 99,3% al 100,0%. Rispetto al ceppo di riferimento, le identità nucleotidiche di questi isolati con GI, GII, GIV e GIII erano rispettivamente 94,8%–95,0%, 96,9%–97,0%, 95,6%–97,3% e 96,9%–99,8%. Le identità amminoacidiche erano rispettivamente 98,5%–98,8%, 98,9%–99,1%, 98,3%–99,5% e 98,7%–100,0%.

L'analisi filogenetica basata sui geni E2 di 28 isolati e 12 interi genomi ha rivelato che tutti gli isolati appartenevano a GIII, lontanamente correlati ad altri gruppi (Figura 3(a,b)). La maggior parte di essi si è raggruppata con la variante GDHYLC23 (Figura 3(b)). L'allineamento della sequenza amminoacidica ha rivelato quattro mutazioni uniche nelle proteine nsP3 ed E2 di questi isolati (Figura 3(c)). La mutazione nsP3 P329S si trova nella regione ZBD, le mutazioni A381T e V503G si trovano nella regione HVD e la proteina E2 ha una mutazione D323E in posizione 323. Sulla base di queste caratteristiche, gli isolati in questo clade sono stati identificati come varianti GIII.

Figura 3. Analisi filogenetica e allineamento della sequenza amminoacidica degli isolati. Analisi filogenetica degli isolati basata su E2 (a) e genoma completo (b).

Conclusione: gli isolati in questo studio appartengono tutti al genotipo GIII, lontanamente correlati ad altri genotipi e possiedono mutazioni uniche degli amminoacidi nelle proteine nsP3 ed E2, confermando che questi isolati sono varianti GIII.

4. Patogenicità del ceppo GETV HNzk-XH1 nei suinetti

A causa dell'elevato tasso di mortalità dei focolai di GETV negli allevamenti suini commerciali e degli alti titoli dei virus GETV isolati dalle cellule BHK-21 e PK-15, il ceppo HNzk-XH1 con titolo più elevato è stato selezionato per la valutazione della patogenicità in questo studio. I suinetti nel gruppo di sfida sono stati iniettati per via intramuscolare con 10⁷TCID₅₀ del ceppo HNzk-XH1, mentre il gruppo di controllo è stato iniettato con un volume uguale di terreno DMEM. Ventiquattro ore dopo la sfida, i suinetti nel gruppo di sfida hanno sviluppato diarrea, seguita da paralisi degli arti posteriori 1,5 giorni dopo. Due giorni dopo, alcuni suinetti sono morti e, entro quattro giorni, tutti i suinetti erano morti, raggiungendo un tasso di mortalità del 100% (Figura 4(c)). I punteggi dei sintomi clinici hanno mostrato che il gruppo HNzk-XH1 aveva sintomi significativamente più gravi rispetto al gruppo di controllo (Figura 4(b)). I suinetti morti sono stati sottoposti ad autopsia immediatamente, mentre il gruppo di controllo è stato sottoposto ad autopsia 8 giorni dopo. La parete dell'intestino tenue del gruppo HNzk-XH1 era significativamente assottigliata, con contenuto giallo e acquoso, mentre l'intestino tenue del gruppo di controllo era normale (Figura 4(a)). L'analisi RT-qPCR ha rivelato che il numero di copie del gene nsP1 di GETV nel sangue prelevato due giorni dopo la sfida era vicino a 10⁶/ml, mentre nessun virus è stato rilevato nel gruppo di controllo (Figura 4(d)). L'esame dei tessuti del fegato, del polmone, del rene, della milza, dell'intestino tenue e del cervello dei suinetti ha rivelato alti carichi virali in tutti gli organi del gruppo infettato da HNzk-XH1, mentre nessun RNA di GETV è stato rilevato nel gruppo di controllo (Figura 4(e)).

Figura 4. Patogenicità nei suinetti

(a) Segni clinici e risultati dell'autopsia dei suinetti infetti. (b) Punteggi clinici dei suinetti infetti.

(c) Tasso di sopravvivenza dei suinetti infetti. (d) Livelli di RNA virale nel sangue intero dei suinetti infetti il giorno 2 post-infezione.

(e) Livelli di RNA virale in diversi organi dei suinetti morti o sottoposti a eutanasia dopo l'infezione.

Conclusione: il ceppo HNzk-XH1 è altamente patogeno per i suinetti, causando rapidamente gravi sintomi clinici e mortalità. Il virus è ampiamente presente nel sangue e negli organi principali. Non sono state osservate anomalie nel gruppo di controllo.

5. Alterazioni patologiche nei topi lattanti infettati con la variante HNzk-XH1

Questo studio dimostra che i topi lattanti sono un modello ideale per studiare la virulenza di GETV. I risultati sperimentali hanno mostrato che l'infezione dei topi lattanti con la variante HNzk-XH1 ha causato paralisi degli arti posteriori e ritardo della crescita (Figura 5(a)) e ha portato a una rapida morte a dosi diverse. Al contrario, il ceppo HNZJ-S1 era meno letale e i topi lattanti infettati con basse dosi sono sopravvissuti e hanno guadagnato peso normale, indicando che c'era una differenza significativa nella patogenicità dei due ceppi nei topi lattanti.

Figura 5. Confronto della patogenicità di HNzk-XH1 e HNZJ-S1

(a) Sintomi clinici dell'infezione nei topi lattanti. (b) Tasso di sopravvivenza dei topi lattanti infettati con diverse dosi del ceppo HNzk-XH1.

(c) Tasso di sopravvivenza dei topi lattanti infettati con diverse dosi del ceppo HNZJ-S1. (d) Variazioni di peso dei topi lattanti infettati con diverse dosi del ceppo HNzk-XH1.

(e) Variazioni di peso dei topi lattanti infettati con diverse dosi del ceppo HNZJ-S1.

Conclusione: la variante HNzk-XH1 è altamente patogena nei topi lattanti, causando paralisi degli arti posteriori, ritardo della crescita e rapida morte. Il ceppo HNZJ-S1 è meno patogeno e i topi lattanti infettati con basse dosi sopravvivono e mantengono un peso corporeo normale, indicando una differenza significativa nella virulenza tra i due ceppi.

Conclusione

Questo studio dimostra che il focolaio di GETV negli allevamenti suini nella provincia di Henan da luglio a settembre 2024 è stato identificato come una variante indipendente e ramificata del gruppo GIII, che ospita quattro mutazioni uniche degli amminoacidi nelle proteine E2 e nsP3. Rispetto agli isolati precedenti, questa variante mostra una maggiore virulenza e potrebbe essere stata silenziosamente trasmessa attraverso suini e zanzare prima del focolaio. Le condizioni climatiche e i modelli di circolazione degli allevamenti suini hanno accelerato la diffusione dell'epidemia. Attualmente, non esiste un vaccino disponibile in Cina, il che richiede una maggiore sorveglianza e adeguamenti tempestivi alle strategie di prevenzione e controllo.