Geta virüsü (GETV), çok çeşitli hayvanları ve insanları tehdit eden, sivrisinek kaynaklı yeni ortaya çıkan bir virüstür. Temmuz'dan Eylül 2024'e kadar, Henan Eyaleti'ndeki domuz çiftliklerinde yoğun bir GETV salgını meydana geldi ve bu, son yıllarda Çin anakarasındaki en yaygın ve yoğun salgınlardan biri oldu.
Temmuz'dan Eylül 2024'e kadar, Geta virüsünün (GETV) yoğun bir salgını Henan Eyaleti'ndeki çok sayıda domuz çiftliğinde meydana geldi. 31 domuz çiftliğinden yirmi yedi suş izole edildi, bunların 22'si filogenetik ağaçta benzersiz bir küme oluşturdu ve nsP3 ve E2 proteinlerinde amino asit mutasyonları sergiledi.
Deneyler, bu GIII varyantının domuz yavrularında önemli ölçüde artmış patojenite sergilediğini, %100 ölüm oranıyla ve ayrıca farelerde yüksek patojenite sergilediğini gösterdi. Bu çalışma, Henan domuz çiftliklerindeki geniş ölçekli bir GETV salgınının ilk sistematik araştırmasıdır ve GIII varyantının artmış virülansını ve moleküler özelliklerini ortaya koymaktadır.
Giriş
Geta virüsü (GETV), çok çeşitli hayvanları enfekte eden ve hatta insanlar için bir tehdit oluşturabilen, tek iplikli, pozitif anlamlı bir RNA virüsüdür. Temmuz'dan Eylül 2024'e kadar, Henan Eyaleti'ndeki ticari domuz çiftliklerinde yoğun bir GETV salgını meydana geldi ve bu, 27 suşun izolasyonuyla sonuçlandı. GIII varyantı, önceki suşlara kıyasla artan virülans sergileyen baskın patojenik suştu. Bu çalışma, GETV'nin moleküler epidemiyolojisini ve patojenitesini anlamak için bir referans sağlamaktadır.
Materyal ve Metotlar
Bu çalışma, domuz GETV izolatı HNJZ-S1'i kültüre etmek için BHK-21 ve PK-15 hücrelerini kullandı. Viral nükleik asit, Henan ve Shanxi'deki şüpheli enfekte domuz çiftliklerinden ekstrakte edildi ve cDNA sentezlendi. Viral tespit, PCR/RT-PCR ile gerçekleştirildi. Pozitif örnekler hücrelerde izole edildi, saflaştırıldı ve tanımlandı. Viral büyüme özellikleri ve plak oluşumu belirlendi. E2 geni ve tüm genom amplifiye edildi, klonlandı ve dizi hizalaması ve filogenetik analiz için dizilendi.
Hayvan deneylerinde, GETV negatif domuz yavrularına ve iki günlük SPF emzirme farelerine virüs intramüsküler veya subkutan olarak enjekte edildi. Klinik belirtiler veya mortalite gözlemlendi ve kanda ve dokularda viral yükler ölçüldü. Viral RNA, doku örneklerinden ekstrakte edildi, cDNA sentezlendi ve daha sonra SYBR Green qPCR ile tespit edildi. Veriler ortalama ± SD olarak sunulur ve GraphPad Prism 9.0 kullanılarak analiz edilir.
Araştırma Sonuçları
1. GETV Örnek Toplama ve Virüs Tespiti
Temmuz 2024'te, Zhumadian, Henan Eyaleti'ndeki bir domuz çiftliğinde 3 ila 10 günlük domuz yavrularında yüksek ölüm oranlı bir salgın meydana geldi ve %30 morbidite oranı ve %80 ölüm oranı görüldü. Laboratuvar onayı, salgının tek bir GETV suşundan kaynaklandığını gösterdi. Daha sonra, Henan Eyaleti genelindeki domuz çiftliklerinde şüpheli GETV salgınları meydana geldi. Klinik örnek toplama, 18 il düzeyindeki şehrin 12'sinde ve 157 ilçenin 21'inde salgınları ortaya çıkardı (Şekil 1(a)). Temmuz'dan Eylül'e kadar sırasıyla bir, 15 ve 16 salgın meydana geldi. Domuz yavrularındaki ana semptomlar şiddetli ishal, ataksi ve arka bacak zayıflığıydı. Otopsilerde şişmiş ve hemorajik lenfadenopati, pulmoner hemorajiler, dağınık yüzeysel hemorajiler ve subkutan ödem ortaya çıktı (Şekil 1(b)). 36 GETV pozitif örneğin sadece ikisi PDCoV, PCV2 veya JEV ile birlikte enfekteydi; geri kalanı tek bir GETV ile enfekteydi (Şekil 1(c)).
Şekil 1. Henan Eyaleti'ndeki Domuz Çiftliklerinde GETV Salgınına Genel Bakış
(a) Henan Eyaleti'ndeki GETV pozitif domuz çiftliklerinin dağılımı. (b) Bu salgın sırasında enfekte domuz yavrularında görülen brüt histolojik lezyonlar.
(c) Doku örneklerinde GETV ve diğer virüslerin PCR ile tanımlanması.
Sonuç: GETV enfeksiyonu, Henan Eyaleti'ndeki çok sayıda çiftlikte domuz yavrularında meydana geldi ve öncelikle tek bir virüsten kaynaklandı. Klinik belirtiler arasında ishal, ataksi ve arka bacak zayıflığı yer alırken, birkaç örnekte karışık enfeksiyonlar meydana geldi.
2. GETV'nin İzolasyonu, Tanımlanması ve Titer Tayini
36 pozitif örnekten, 28 GETV suşu BHK-21 hücrelerinde başarıyla izole edildi. HNzk-XH1 ve HNzmd-XP1, GETV olarak tanımlandı. BHK-21 veya PK-15 hücrelerinde 48 saatlik enfeksiyondan sonra, kontrollere kıyasla hücre büzülmesi, yuvarlaklaşma ve eksfoliasyon dahil olmak üzere önemli sitopatik değişiklikler gözlemlendi. RT-PCR ve elektron mikroskobu, viral kimliği daha da doğruladı. Proliferasyon eğrileri, iki virüs suşunun büyüme kinetiğinin benzer olduğunu, enfeksiyondan 36 saat sonra zirveye ulaştığını ve ardından azaldığını gösterdi. Plak deneyi sonuçları, iki virüs suşunun plaklarının boyut olarak benzer olduğunu, ancak sayılarında farklılık gösterdiğini gösterdi.
Şekil 2. GETV'nin İzolasyonu ve Karakterizasyonu
(A) BHK-21 ve PK-15 hücrelerinin HNzk-XH1 veya HNzmd-XP1 ile enfeksiyonundan sonra, 12 ila 36 saat içinde sitopatik etkiler gözlemlendi.
(B) GETV izolatları RT-PCR ile tanımlandı. (C) GETV partikül morfolojisi elektron mikroskobu ile incelendi.
(d) HNzk-XH1 veya HNzmd-XP1'in BHK-21 ve PK-15 hücrelerindeki büyümesi. (e) BHK-21 hücrelerinde GETV'nin plak morfolojisi.
Sonuç: GETV suşları HNzk-XH1 ve HNzmd-XP1, domuz çiftliği örneklerinden başarıyla izole edildi. Her iki suş da hücrelerde önemli sitopatik etkilere neden oldu, benzer büyüme kinetiği ve titer varyasyonları gösterdi, ancak plak sayılarında farklılıklar vardı.
3. Dizileme ve Filogenetik Analiz
Bu çalışmada elde edilen tüm genom dizileri (GenBank erişim numaraları: PQ658739–PQ658750) ve E2 gen dizileri (GenBank erişim numaraları: PQ658751–PQ658766) GenBank'a gönderildi. Tüm genom homoloji analizi, izolatlar arasındaki nükleotid kimliğinin %98,4 ila %100,0 arasında ve amino asit kimliğinin %99,3 ila %100,0 arasında değiştiğini gösterdi. Referans suşla karşılaştırıldığında, bu izolatların GI, GII, GIV ve GIII ile nükleotid kimlikleri sırasıyla %94,8–%95,0, %96,9–%97,0, %95,6–%97,3 ve %96,9–%99,8 idi. Amino asit kimlikleri sırasıyla %98,5–%98,8, %98,9–%99,1, %98,3–%99,5 ve %98,7–%100,0 idi.
28 izolatın E2 genlerine ve 12 tüm genomuna dayalı filogenetik analiz, tüm izolatların GIII'e ait olduğunu, diğer gruplarla uzaktan ilişkili olduğunu ortaya koydu (Şekil 3(a,b)). Çoğu, GDHYLC23 varyantı ile kümelendi (Şekil 3(b)). Amino asit dizisi hizalaması, bu izolatların nsP3 ve E2 proteinlerinde dört benzersiz mutasyon ortaya koydu (Şekil 3(c)). nsP3 P329S mutasyonu ZBD bölgesinde, A381T ve V503G mutasyonları HVD bölgesinde yer alırken, E2 proteini 323. pozisyonda D323E mutasyonuna sahiptir. Bu özelliklere dayanarak, bu klon içindeki izolatlar GIII varyantları olarak tanımlandı.
Şekil 3. İzolatların filogenetik analizi ve amino asit dizisi hizalaması. İzolatların E2'ye (a) ve tam genoma (b) dayalı filogenetik analizi.
Sonuç: Bu çalışmadaki izolatların tümü, diğer genotiplerle uzaktan ilişkili olan GIII genotipine aittir ve nsP3 ve E2 proteinlerinde benzersiz amino asit mutasyonlarına sahiptir ve bu izolatların GIII varyantları olduğunu doğrulamaktadır.
4. GETV HNzk-XH1 Suşunun Domuz Yavrularındaki Patojenitesi
Ticari domuz çiftliklerindeki GETV salgınlarının yüksek ölüm oranı ve BHK-21 ve PK-15 hücrelerinden izole edilen GETV virüslerinin yüksek titreleri nedeniyle, bu çalışmada daha yüksek titreli HNzk-XH1 suşu patojenite değerlendirmesi için seçildi. Mücadele grubundaki domuz yavrularına 10⁷TCID₅₀ HNzk-XH1 suşu intramüsküler olarak enjekte edilirken, kontrol grubuna eşit hacimde DMEM ortamı enjekte edildi. Mücadeleden yirmi dört saat sonra, mücadele grubundaki domuz yavrularında ishal gelişti, bunu 1,5 gün sonra arka bacak felci izledi. İki gün sonra, bazı domuz yavruları öldü ve dört gün içinde tüm domuz yavruları öldü ve %100 ölüm oranına ulaşıldı (Şekil 4(c)). Klinik semptom skorları, HNzk-XH1 grubunun kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha şiddetli semptomlara sahip olduğunu gösterdi (Şekil 4(b)). Ölen domuz yavrularına hemen otopsi yapılırken, kontrol grubuna 8 gün sonra otopsi yapıldı. HNzk-XH1 grubunun ince bağırsak duvarı önemli ölçüde incelmiş, sarı, sulu içeriklere sahipken, kontrol grubunun ince bağırsağı normaldi (Şekil 4(a)). RT-qPCR analizi, mücadeleden iki gün sonra toplanan kandaki GETV nsP1 gen kopyası sayısının 10⁶/ml'ye yakın olduğunu gösterirken, kontrol grubunda virüs tespit edilmedi (Şekil 4(d)). Domuz yavrularının karaciğer, akciğer, böbrek, dalak, ince bağırsak ve beyin dokularının incelenmesi, HNzk-XH1 ile enfekte gruptaki tüm organlarda yüksek viral yükler ortaya koyarken, kontrol grubunda GETV RNA'sı tespit edilmedi (Şekil 4(e)).
Şekil 4. Domuz Yavrularında Patojenite
(a) Enfekte domuz yavrularının klinik belirtileri ve otopsi sonuçları. (b) Enfekte domuz yavrularının klinik skorları.
(c) Enfekte domuz yavrularının hayatta kalma oranı. (d) Enfekte domuz yavrularının tam kanındaki viral RNA seviyeleri, enfeksiyondan 2 gün sonra.
(e) Enfeksiyondan sonra ölen veya ötenazi uygulanan domuz yavrularının farklı organlarındaki viral RNA seviyeleri.
Sonuç: HNzk-XH1 suşu, domuz yavruları için oldukça patojendir, hızla şiddetli klinik semptomlara ve ölüme neden olur. Virüs, kanda ve ana organlarda yaygın olarak bulunur. Kontrol grubunda herhangi bir anormallik gözlemlenmedi.
5. HNzk-XH1 varyantı ile enfekte emzirme farelerindeki patolojik değişiklikler
Bu çalışma, emzirme farelerinin GETV'nin virülansını incelemek için ideal bir model olduğunu göstermektedir. Deneysel sonuçlar, emzirme farelerinin HNzk-XH1 varyantı ile enfeksiyonunun arka bacak felcine ve büyüme geriliğine neden olduğunu (Şekil 5(a)) ve farklı dozlarda hızlı ölüme yol açtığını gösterdi. Buna karşılık, HNZJ-S1 suşu daha az ölümcüldü ve düşük dozlarla enfekte emzirme fareleri hayatta kaldı ve normal kilo aldı, bu da iki suşun emzirme farelerindeki patojenitesinde önemli bir fark olduğunu gösterdi.
Şekil 5. HNzk-XH1 ve HNZJ-S1'in Patojenitesinin Karşılaştırılması
(a) Emzirme farelerinde enfeksiyonun klinik semptomları. (b) Farklı dozlarda HNzk-XH1 suşu ile enfekte emzirme farelerinin hayatta kalma oranı.
(c) Farklı dozlarda HNZJ-S1 suşu ile enfekte emzirme farelerinin hayatta kalma oranı. (d) Farklı dozlarda HNzk-XH1 suşu ile enfekte emzirme farelerinin ağırlık değişiklikleri.
(e) Farklı dozlarda HNZJ-S1 suşu ile enfekte emzirme farelerinin ağırlık değişiklikleri.
Sonuç: HNzk-XH1 varyantı, emzirme farelerinde oldukça patojendir, arka bacak felcine, büyüme geriliğine ve hızlı ölüme neden olur. HNZJ-S1 suşu daha az patojendir ve düşük dozlarla enfekte emzirme fareleri hayatta kalır ve normal vücut ağırlığını korur, bu da iki suş arasında virülansta önemli bir fark olduğunu gösterir.
Sonuç
Bu çalışma, Henan Eyaleti'ndeki domuz çiftliklerinde Temmuz'dan Eylül 2024'e kadar meydana gelen GETV salgınının, E2 ve nsP3 proteinlerinde dört benzersiz amino asit mutasyonu barındıran, GIII grubunun bağımsız, dallanan bir varyantı olarak tanımlandığını göstermektedir. Önceki izolatlara kıyasla, bu varyant artmış virülans sergiler ve salgından önce domuzlar ve sivrisinekler aracılığıyla sessizce bulaşmış olabilir. İklim koşulları ve domuz çiftliği dolaşım modelleri, salgının yayılmasını hızlandırdı. Şu anda Çin'de mevcut bir aşı bulunmamaktadır, bu da geliştirilmiş gözetim ve önleme ve kontrol stratejilerine zamanında ayarlamalar yapılmasını gerektirmektedir.
Mesajınız 20-3.000 karakter arasında olmalıdır!