Virus Geta (GETV) là một loại virus lây truyền qua muỗi đang nổi lên, đe dọa nhiều loài động vật và con người. Từ tháng 7 đến tháng 9 năm 2024, một đợt bùng phát GETV tập trung đã xảy ra tại các trang trại nuôi lợn trên khắp tỉnh Hà Nam, đánh dấu một trong những đợt bùng phát lan rộng và tập trung nhất ở Trung Quốc đại lục trong những năm gần đây.
Từ tháng 7 đến tháng 9 năm 2024, một đợt bùng phát virus Geta (GETV) tập trung đã xảy ra tại nhiều trang trại nuôi lợn ở tỉnh Hà Nam. Hai mươi bảy chủng đã được phân lập từ 31 trang trại nuôi lợn, 22 trong số đó tạo thành một cụm độc đáo trong cây phát sinh loài và thể hiện các đột biến axit amin trong protein nsP3 và E2.
Các thí nghiệm đã chứng minh rằng biến thể GIII này thể hiện khả năng gây bệnh tăng cường đáng kể ở lợn con, với tỷ lệ tử vong 100%, và cũng thể hiện khả năng gây bệnh cao ở chuột. Nghiên cứu này là nghiên cứu có hệ thống đầu tiên về đợt bùng phát GETV quy mô lớn ở các trang trại nuôi lợn Hà Nam, tiết lộ độc lực tăng cường và các đặc điểm phân tử của biến thể GIII.
Giới thiệu
Virus Geta (GETV) là một loại virus RNA sợi đơn, cảm giác dương tính, lây nhiễm cho nhiều loài động vật và thậm chí có thể gây ra mối đe dọa cho con người. Từ tháng 7 đến tháng 9 năm 2024, một đợt bùng phát GETV tập trung đã xảy ra tại các trang trại nuôi lợn thương mại ở tỉnh Hà Nam, dẫn đến việc phân lập 27 chủng. Biến thể GIII là chủng gây bệnh chủ yếu, thể hiện độc lực tăng lên so với các chủng trước đó. Nghiên cứu này cung cấp một tài liệu tham khảo để hiểu về dịch tễ học phân tử và khả năng gây bệnh của GETV.
Vật liệu và Phương pháp
Nghiên cứu này đã sử dụng tế bào BHK-21 và PK-15 để nuôi cấy dòng GETV lợn HNJZ-S1. Axit nucleic của virus đã được chiết xuất từ các trang trại nuôi lợn bị nghi ngờ nhiễm bệnh ở Hà Nam và Sơn Tây, và cDNA đã được tổng hợp. Việc phát hiện virus được thực hiện bằng PCR/RT-PCR. Các mẫu dương tính đã được phân lập, tinh sạch và xác định trong tế bào. Các đặc điểm tăng trưởng của virus và sự hình thành mảng bám đã được xác định. Gen E2 và toàn bộ bộ gen đã được khuếch đại, nhân bản và giải trình tự để sắp xếp trình tự và phân tích phát sinh loài.
Trong các thí nghiệm trên động vật, lợn con âm tính với GETV và chuột con SPF hai ngày tuổi đã được tiêm bắp hoặc dưới da bằng virus. Các dấu hiệu lâm sàng hoặc tỷ lệ tử vong đã được quan sát, và tải lượng virus trong máu và các mô đã được đo. RNA virus đã được chiết xuất từ các mẫu mô, cDNA đã được tổng hợp, và sau đó được phát hiện bằng SYBR Green qPCR. Dữ liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± SD và được phân tích bằng GraphPad Prism 9.0.
Kết quả nghiên cứu
1. Thu thập mẫu GETV và phát hiện virus
Vào tháng 7 năm 2024, một đợt bùng phát tỷ lệ tử vong cao đã xảy ra ở lợn con từ 3 đến 10 ngày tuổi tại một trang trại nuôi lợn ở Trú Mã Điếm, tỉnh Hà Nam, với tỷ lệ mắc bệnh là 30% và tỷ lệ tử vong là 80%. Xác nhận trong phòng thí nghiệm cho thấy đợt bùng phát là do một chủng GETV duy nhất gây ra. Sau đó, các đợt bùng phát GETV nghi ngờ đã xảy ra tại các trang trại nuôi lợn trên khắp tỉnh Hà Nam. Việc thu thập mẫu lâm sàng cho thấy các đợt bùng phát ở 12 trong số 18 thành phố cấp tỉnh và 21 trong số 157 quận (Hình 1(a)). Từ tháng 7 đến tháng 9, có một, 15 và 16 đợt bùng phát, tương ứng. Các triệu chứng chính ở lợn con là tiêu chảy nặng, mất điều hòa và yếu chân sau. Khám nghiệm tử thi cho thấy sưng và xuất huyết hạch bạch huyết, xuất huyết phổi, xuất huyết bề mặt rải rác và phù dưới da (Hình 1(b)). Trong số 36 mẫu dương tính với GETV, chỉ có hai mẫu bị đồng nhiễm với PDCoV, PCV2 hoặc JEV; phần còn lại bị nhiễm một loại GETV duy nhất (Hình 1(c)).
Hình 1. Tổng quan về đợt bùng phát GETV tại các trang trại nuôi lợn ở tỉnh Hà Nam
(a) Phân bố các trang trại nuôi lợn dương tính với GETV ở tỉnh Hà Nam. (b) Tổn thương mô học thô ở lợn con bị nhiễm bệnh trong đợt bùng phát này.
(c) Nhận dạng PCR của GETV và các loại virus khác trong các mẫu mô.
Kết luận: Nhiễm GETV đã xảy ra ở lợn con tại nhiều trang trại ở tỉnh Hà Nam, chủ yếu do một loại virus duy nhất gây ra. Các biểu hiện lâm sàng bao gồm tiêu chảy, mất điều hòa và yếu chân sau, với các bệnh nhiễm trùng hỗn hợp xảy ra ở một vài mẫu.
2. Phân lập, nhận dạng và xác định độ chuẩn của GETV
Từ 36 mẫu dương tính, 28 chủng GETV đã được phân lập thành công trong tế bào BHK-21. HNzk-XH1 và HNzmd-XP1 được xác định là GETV. Sau 48 giờ nhiễm bệnh trong tế bào BHK-21 hoặc PK-15, những thay đổi gây bệnh tế bào đáng kể, bao gồm co tế bào, làm tròn và bong tróc, đã được quan sát so với các mẫu đối chứng. RT-PCR và kính hiển vi điện tử tiếp tục xác nhận danh tính của virus. Các đường cong tăng sinh cho thấy động học tăng trưởng của hai chủng virus là tương tự nhau, với độ chuẩn đạt đỉnh sau 36 giờ sau khi nhiễm bệnh và sau đó giảm. Kết quả xét nghiệm mảng bám cho thấy các mảng bám của hai chủng virus có kích thước tương tự nhau, nhưng khác nhau về số lượng.
Hình 2. Phân lập và đặc điểm của GETV
(A) Sau khi nhiễm tế bào BHK-21 và PK-15 bằng HNzk-XH1 hoặc HNzmd-XP1, các tác động gây bệnh tế bào đã được quan sát trong vòng 12 đến 36 giờ.
(B) Các dòng GETV đã được xác định bằng RT-PCR. (C) Hình thái hạt GETV đã được kiểm tra bằng kính hiển vi điện tử.
(d) Sự phát triển của HNzk-XH1 hoặc HNzmd-XP1 trong tế bào BHK-21 và PK-15. (e) Hình thái mảng bám của GETV trên tế bào BHK-21.
Kết luận: Các chủng GETV HNzk-XH1 và HNzmd-XP1 đã được phân lập thành công từ các mẫu trang trại lợn. Cả hai chủng đều gây ra các tác động gây bệnh tế bào đáng kể trong tế bào, với động học tăng trưởng và các biến thể độ chuẩn tương tự, nhưng khác biệt về số lượng mảng bám.
3. Giải trình tự và phân tích phát sinh loài
Các trình tự bộ gen hoàn chỉnh (số truy cập GenBank: PQ658739–PQ658750) và trình tự gen E2 (số truy cập GenBank: PQ658751–PQ658766) thu được trong nghiên cứu này đã được gửi đến GenBank. Phân tích tương đồng bộ gen hoàn chỉnh cho thấy tính đồng nhất nucleotide giữa các dòng dao động từ 98,4% đến 100,0%, và tính đồng nhất axit amin dao động từ 99,3% đến 100,0%. So với dòng tham chiếu, tính đồng nhất nucleotide của các dòng này với GI, GII, GIV và GIII lần lượt là 94,8%–95,0%, 96,9%–97,0%, 95,6%–97,3% và 96,9%–99,8%. Tính đồng nhất axit amin lần lượt là 98,5%–98,8%, 98,9%–99,1%, 98,3%–99,5% và 98,7%–100,0%.
Phân tích phát sinh loài dựa trên các gen E2 của 28 dòng và 12 bộ gen hoàn chỉnh cho thấy tất cả các dòng đều thuộc GIII, có liên quan xa đến các nhóm khác (Hình 3(a,b)). Hầu hết chúng tập trung với biến thể GDHYLC23 (Hình 3(b)). Sắp xếp trình tự axit amin cho thấy bốn đột biến độc đáo trong protein nsP3 và E2 của các dòng này (Hình 3(c)). Đột biến nsP3 P329S nằm trong vùng ZBD, các đột biến A381T và V503G nằm trong vùng HVD, và protein E2 có đột biến D323E ở vị trí 323. Dựa trên các đặc điểm này, các dòng trong nhánh này được xác định là các biến thể GIII.
Hình 3. Phân tích phát sinh loài và sắp xếp trình tự axit amin của các dòng. Phân tích phát sinh loài của các dòng dựa trên E2 (a) và bộ gen hoàn chỉnh (b).
Kết luận: Các dòng trong nghiên cứu này đều thuộc kiểu gen GIII, có liên quan xa đến các kiểu gen khác và có các đột biến axit amin độc đáo trong protein nsP3 và E2, xác nhận rằng các dòng này là các biến thể GIII.
4. Khả năng gây bệnh của chủng GETV HNzk-XH1 ở lợn con
Do tỷ lệ tử vong cao của các đợt bùng phát GETV trong các trang trại nuôi lợn thương mại và độ chuẩn cao của virus GETV được phân lập từ tế bào BHK-21 và PK-15, chủng HNzk-XH1 có độ chuẩn cao hơn đã được chọn để đánh giá khả năng gây bệnh trong nghiên cứu này. Lợn con trong nhóm thử thách đã được tiêm bắp với 10⁷TCID₅₀ của chủng HNzk-XH1, trong khi nhóm đối chứng được tiêm một lượng môi trường DMEM tương đương. Hai mươi bốn giờ sau khi thử thách, lợn con trong nhóm thử thách đã phát triển tiêu chảy, sau đó là liệt chân sau 1,5 ngày sau đó. Hai ngày sau, một số lợn con đã chết, và trong vòng bốn ngày, tất cả lợn con đã chết, đạt tỷ lệ tử vong 100% (Hình 4(c)). Điểm triệu chứng lâm sàng cho thấy nhóm HNzk-XH1 có các triệu chứng nghiêm trọng hơn đáng kể so với nhóm đối chứng (Hình 4(b)). Lợn con chết đã được khám nghiệm tử thi ngay lập tức, trong khi nhóm đối chứng được khám nghiệm tử thi 8 ngày sau đó. Thành ruột non của nhóm HNzk-XH1 mỏng đi đáng kể, với các chất lỏng màu vàng, trong khi ruột non của nhóm đối chứng là bình thường (Hình 4(a)). Phân tích RT-qPCR cho thấy số lượng bản sao gen nsP1 GETV trong máu được thu thập hai ngày sau khi thử thách gần 10⁶/ml, trong khi không phát hiện thấy virus trong nhóm đối chứng (Hình 4(d)). Kiểm tra các mô gan, phổi, thận, lá lách, ruột non và não của lợn con cho thấy tải lượng virus cao trong tất cả các cơ quan của nhóm bị nhiễm HNzk-XH1, trong khi không phát hiện thấy RNA GETV trong nhóm đối chứng (Hình 4(e)).
Hình 4. Khả năng gây bệnh ở lợn con
(a) Các dấu hiệu lâm sàng và kết quả khám nghiệm tử thi của lợn con bị nhiễm bệnh. (b) Điểm lâm sàng của lợn con bị nhiễm bệnh.
(c) Tỷ lệ sống sót của lợn con bị nhiễm bệnh. (d) Mức RNA virus trong máu toàn phần của lợn con bị nhiễm bệnh vào ngày thứ 2 sau khi nhiễm bệnh.
(e) Mức RNA virus trong các cơ quan khác nhau của lợn con đã chết hoặc bị an tử sau khi nhiễm bệnh.
Kết luận: Chủng HNzk-XH1 có khả năng gây bệnh cao cho lợn con, nhanh chóng gây ra các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng và tử vong. Virus có mặt rộng rãi trong máu và các cơ quan chính. Không có bất thường nào được quan sát thấy trong nhóm đối chứng.
5. Thay đổi bệnh lý ở chuột con bú bị nhiễm biến thể HNzk-XH1
Nghiên cứu này chứng minh rằng chuột con bú là một mô hình lý tưởng để nghiên cứu độc lực của GETV. Kết quả thí nghiệm cho thấy việc nhiễm biến thể HNzk-XH1 cho chuột con bú gây ra liệt chân sau và chậm phát triển (Hình 5(a)), và dẫn đến tử vong nhanh chóng ở các liều khác nhau. Ngược lại, chủng HNZJ-S1 ít gây chết người hơn, và chuột con bú bị nhiễm liều thấp đã sống sót và tăng cân bình thường, cho thấy có sự khác biệt đáng kể về khả năng gây bệnh của hai chủng ở chuột con bú.
Hình 5. So sánh khả năng gây bệnh của HNzk-XH1 và HNZJ-S1
(a) Các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhiễm trùng ở chuột con bú. (b) Tỷ lệ sống sót của chuột con bú bị nhiễm các liều khác nhau của chủng HNzk-XH1.
(c) Tỷ lệ sống sót của chuột con bú bị nhiễm các liều khác nhau của chủng HNZJ-S1. (d) Thay đổi trọng lượng của chuột con bú bị nhiễm các liều khác nhau của chủng HNzk-XH1.
(e) Thay đổi trọng lượng của chuột con bú bị nhiễm các liều khác nhau của chủng HNZJ-S1.
Kết luận: Biến thể HNzk-XH1 có khả năng gây bệnh cao ở chuột con bú, gây liệt chân sau, chậm phát triển và tử vong nhanh chóng. Chủng HNZJ-S1 ít gây bệnh hơn, và chuột con bú bị nhiễm liều thấp sống sót và duy trì trọng lượng cơ thể bình thường, cho thấy sự khác biệt đáng kể về độc lực giữa hai chủng.
Kết luận
Nghiên cứu này chứng minh rằng đợt bùng phát GETV tại các trang trại nuôi lợn ở tỉnh Hà Nam từ tháng 7 đến tháng 9 năm 2024 đã được xác định là một biến thể độc lập, phân nhánh của nhóm GIII, mang bốn đột biến axit amin độc đáo trong protein E2 và nsP3. So với các dòng trước đó, biến thể này thể hiện độc lực tăng cường và có thể đã được truyền lặng lẽ qua lợn và muỗi trước khi đợt bùng phát xảy ra. Điều kiện khí hậu và mô hình lưu thông của trang trại lợn đã đẩy nhanh sự lây lan của dịch bệnh. Hiện tại, không có vắc xin nào có sẵn ở Trung Quốc, đòi hỏi phải tăng cường giám sát và điều chỉnh kịp thời các chiến lược phòng ngừa và kiểm soát.
Người liên hệ: Mr. Huang Jingtai
Tel: 17743230916
