Гета-вирус (GETV) - новый вирус, передаваемый комарами, который угрожает широкому кругу животных и людей.концентрационная вспышка ГЭТВ произошла на свиноводческих фермах в провинции Хэнань, что является одной из самых распространенных и сконцентрированных вспышек в материковом Китае за последние годы.
С июля по сентябрь 2024 года в провинции Хэнань в нескольких свиноводческих хозяйствах произошла сконцентрированная вспышка вируса гета (GETV).22 из них образовали уникальный кластер в филогенетическом дереве и продемонстрировали мутации аминокислот в белках nsP3 и E2..
Эксперименты показали, что этот вариант GIII демонстрировал значительно повышенную патогенность у поросят с показателем летальности 100%, а также высокую патогенность у мышей.Это исследование является первым систематическим исследованием крупномасштабной вспышки ГЭТВ на свиноводческих фермах в провинции Хэнань., что показывает повышенную вирулентность и молекулярные характеристики варианта GIII.
Введение
Гета-вирус (GETV) - одноцепочечный РНК-вирус с положительным чувством, который инфицирует широкий спектр животных и может даже представлять угрозу для человека.в провинции Хэнань в коммерческих свиноводческих хозяйствах произошла сконцентрированная вспышка ГЭТВВ результате изолировано 27 штаммов. Вариант GIII был преобладающим патогенным штаммом, демонстрирующим повышенную вирулентность по сравнению с предыдущими штаммами.Данное исследование является справочником для понимания молекулярной эпидемиологии и патогенности GETV..
Материалы и методы
В данном исследовании для культивирования изолята HNJZ-S1 GETV свиней были использованы клетки BHK-21 и PK-15. Вирусная нуклеиновая кислота была извлечена из подозреваемых инфицированных свиноферм в провинциях Хэнань и Шаньси, и была синтезирована cDNA.Вирус обнаружили ПЦР/РТ-ПЦРПоложительные образцы были изолированы, очищены и идентифицированы в клетках. Были определены характеристики роста вируса и образование бляшек. Ген E2 и весь геном были усилены, клонированы,и последовательность для выравнивания последовательности и филогенетического анализа.
В экспериментах с животными, с GETV отрицательными поросят и двухдневные SPF кормящие мыши были инъекционированы внутримышечно или подкожно с вирусом.и вирусные нагрузки в крови и тканях были измереныВирусная РНК была извлечена из образцов тканей, cDNA была синтезирована, а затем обнаружена SYBR Green qPCR. Данные представлены как средние ± SD и проанализированы с помощью GraphPad Prism 9.0.
Результаты исследований
1. GETV Сбор проб и выявление вирусов
В июле 2024 года в свиноводческой ферме в Чжумадиане, провинция Хэнань, произошла вспышка с высокой смертностью у поросят в возрасте от 3 до 10 дней, уровень заболеваемости составил 30% и уровень смертности 80%.Лабораторное подтверждение показало, что вспышка была вызвана одним штаммом GETVВпоследствии в свиноводческих хозяйствах провинции Хэнань произошли подозрительные вспышки ГЭТВ.Клинический сбор проб выявил вспышки в 12 из 18 городов на уровне префектур и в 21 из 157 округов (рис. 1 ((a))С июля по сентябрь были зарегистрированы 1, 15 и 16 вспышек соответственно.Вскрытия показали опухшую и геморрагическую лимфаденопатию., легочные кровоизлияния, рассеянные поверхностные кровоизлияния и подкожная отечность (рисунок 1 ((b)). Из 36 положительных образцов GETV только два были соинфицированы PDCoV, PCV2 или JEV;остальные были инфицированы одной ГЭТВ (рис. 1 ((c)).
Рисунок 1. Обзор вспышки ГЭТВ на свиноводческих фермах в провинции Хэнань
(а) Распределение ферм свиней с GETV в провинции Хэнань. (б) Грубое гистологическое поражение инфицированных поросят во время этой вспышки.
c) ПЦР-идентификация GETV и других вирусов в образцах тканей.
Заключение: инфекция GETV возникла у поросят на нескольких фермах в провинции Хэнань, в основном вызвана одним вирусом.с смешанными инфекциями, встречающимися в нескольких образцах.
2Изоляция, идентификация и определение титра GETV
Из 36 положительных образцов 28 штаммов GETV были успешно изолированы в клетках BHK-21. HNzk-XH1 и HNzmd-XP1 были идентифицированы как GETV.значительные цитопатические измененияRT-PCR и электронная микроскопия подтвердили вирусную идентичность.Кривые распространения показали, что кинетика роста двух штаммов вируса была схожа.Результаты анализа бляшек показали, что бляшки двух штаммов вируса были одинаковыми по размеру, но отличались по количеству.
Рисунок 2. Изоляция и характеристика GETV
(A) После инфицирования клеток BHK-21 и PK-15 HNzk- XH1 или HNzmd- XP1 цитопатические эффекты наблюдались в течение 12 - 36 часов.
(B) Изоляты GETV были идентифицированы с помощью RT-PCR. (C) Морфология частиц GETV была изучена с помощью электронной микроскопии.
(d) Рост HNzk-XH1 или HNzmd-XP1 в клетках BHK-21 и PK-15. (e) Морфология бляшек GETV на клетках BHK-21.
Заключение: штаммы GETV HNzk-XH1 и HNzmd-XP1 были успешно изолированы из образцов свиноводческих ферм.с аналогичной кинетикой роста и изменениями титра, но с различиями в количестве бляшек.
3Секвенирование и филогенетический анализ
Секвенции целого генома (номера аккредитации GenBank: PQ658739?? PQ658750) и последовательности генов E2 (номера аккредитации GenBank: PQ658751?? PQ658766) полученные в этом исследовании были представлены GenBank.Анализ гомологии всего генома показал, что нуклеотидная идентичность среди изолятов составляла от 98 до0,4% до 100,0%, а идентичность аминокислот колебалась от 99,3% до 100,0%. По сравнению с эталонным штаммом, нуклеотидные идентичности этих изолятов с GI, GII, GIV и GIII составляли 94,8%95,0%, 96Аминокислотные идентичности составляли 98,5%98,8%, 98,9%99,1%, 98,3%99,5% и 98,7%100,0%, соответственно.
Филогенетический анализ, основанный на генах E2 28 изолятов и 12 целых геномов, показал, что все изоляты принадлежали к GIII, отдаленно связанным с другими группами (рисунок 3 ((a, b)).Большинство из них были сгруппированы с вариантом GDHYLC23 (рисунок 3 ((b)). Установка последовательности аминокислот показала четыре уникальных мутации в белках nsP3 и E2 этих изолятов (рисунок 3 ((c)).мутации A381T и V503G расположены в области HVD, а белок E2 имеет мутацию D323E на позиции 323. На основе этих характеристик изоляты этого клада были идентифицированы как варианты GIII.
Филогенетический анализ и выравнивание последовательности аминокислот изолятов Филогенетический анализ изолятов на основе E2 (a) и полного генома (b).
Заключение: Изоляты в этом исследовании принадлежат к генотипу GIII, отдаленно связанным с другими генотипами, и обладают уникальными мутациями аминокислот в белках nsP3 и E2,подтверждающее, что эти изоляты являются вариантами GIII.
4Патогенность штамма GETV HNzk-XH1 у поросят
В связи с высоким уровнем смертности от вспышек ГЭТВ на коммерческих свиноводческих фермах и высокими титрами вирусов ГЭТВ, изолированных из клеток BHK-21 и PK-15,В данном исследовании для оценки патогенности был выбран штамм HNzk-XH1 с более высоким титромСвиньям в испытательной группе внутримышечно вводили 107TCID50 штамма HNzk-XH1, в то время как контрольной группе вводили равный объем DMEM.24 часа после испытанияЧерез два дня некоторые поросят умерли, а через четыре дня все поросят умерли.достижение 100% смертности (рисунок 4 ((c))Клинические показатели симптомов показали, что группа HNzk-XH1 имела значительно более тяжелые симптомы, чем контрольная группа (рисунок 4 (b)).В то время как в контрольной группе было сделано вскрытие 8 дней спустяСтенка тонкого кишечника в группе HNzk-XH1 была значительно истончена, с желтым, водянистым содержанием, в то время как тонкий кишечник в контрольной группе был нормальным (рисунок 4 (a)).Анализ RT-qPCR показал, что количество копий гена GETV nsP1 в крови, собранной через два дня после испытания, было близко к 106/ мл., в то время как вирус не был обнаружен в контрольной группе (рисунок 4 ((d)).и тканей головного мозга поросят обнаружили высокую вирусную нагрузку во всех органах группы, инфицированной HNzk- XH1, в то время как в контрольной группе не было обнаружено РНК GETV (рисунок 4 ((e)).
Рисунок 4. Патогенность у поросят
(а) Клинические признаки и результаты вскрытия инфицированных поросят. (б) Клинические результаты инфицированных поросят.
(c) Уровень выживаемости инфицированных поросят. (d) Уровень вирусной РНК в цельной крови инфицированных поросят на 2-й день после заражения.
e) Вирусные уровни РНК в различных органах поросят, которые умерли или были эвтаназированы после заражения.
Вывод: штамм HNzk-XH1 является высокопатогенным для поросят, быстро вызывая тяжелые клинические симптомы и смертность.В контрольной группе не наблюдалось аномалий..
5Патологические изменения у кормящих мышей, инфицированных вариантом HNzk-XH1
Это исследование показывает, что мыши-саки являются идеальной моделью для изучения вирулентности GETV.Результаты эксперимента показали, что инфекция кормящих мышей вариантом HNzk-XH1 вызывает паралич задних конечностей и замедление роста (рис. 5 ((a))Напротив, штамм HNZJ-S1 был менее смертоносным, а кормящие мыши, инфицированные низкими дозами, выжили и набрали нормальный вес.указывающее на наличие значительной разницы в патогенности двух штаммов у мышей, которые грудят.
Рисунок 5. Сравнение патогенности HNzk-XH1 и HNZJ-S1
(а) Клинические симптомы инфекции у мышей, кормящих грудью. (б) Уровень выживаемости у мышей, кормящих грудью, инфицированных различными дозами штамма HNzk-XH1.
(c) Уровень выживаемости мышей, инфицированных различными дозами штамма HNZJ-S1. (d) Изменения веса мышей, инфицированных различными дозами штамма HNzk-XH1.
(e) Изменения веса мышей в грудном вскармливании, инфицированных различными дозами штамма HNZJ-S1.
Вывод: вариант HNzk-XH1 является высокопатогенным у мышей, вызывающих паралич задних конечностей, замедление роста и быструю смерть.и кормящие мыши, инфицированные низкими дозами, выживают и сохраняют нормальную массу тела, что указывает на значительную разницу в вирулентности между двумя штаммами.
Заключение
Данное исследование показывает, что вспышка ГЕТВ на свиноводческих фермах в провинции Хэнань с июля по сентябрь 2024 года была определена как независимый, разветвленный вариант группы GIII,содержащие четыре уникальных мутации аминокислот в белках E2 и nsP3По сравнению с предыдущими изолятами этот вариант проявляет повышенную вирулентность и, возможно, незаметно передавался через свиней и комаров до вспышки.Климатические условия и схемы обращения свиноводческих хозяйств ускорили распространение эпидемииВ настоящее время в Китае нет вакцины, поэтому необходимо усилить наблюдение и своевременно корректировать стратегии профилактики и контроля.
Ваше сообщение должно содержать от 20 до 3000 символов!