wiadomości o firmie Najnowsze wyniki badań. Rozpowszechnienie wariantów Getawirusa GIII z zwiększoną wirulencją w farmach świń w prowincji Henan.

Wirus Geta (GETV) to wirus przenoszony przez komary, który zagraża wielu zwierzętom i ludziom. Od lipca do września 2024 r.koncentrowane ognisko GETV wystąpiło w gospodarstwach wieprzowych w prowincji Henan, co oznacza jedno z najbardziej rozpowszechnionych i skoncentrowanych epidemii w Chinach kontynentalnych w ostatnich latach.

W okresie od lipca do września 2024 r. w kilku gospodarstwach wieprzowych w prowincji Henan wystąpił skoncentrowany wybuch wirusa Geta (GETV). W 31 gospodarstwach wieprzowych wyizolowano 27 szczepów,22 z nich tworzyło unikalny zespół w drzewie filogenetycznym i wykazywały mutacje aminokwasów w białkach nsP3 i E2..

Eksperymenty wykazały, że ten wariant GIII wykazywał znacząco zwiększoną patogenność u prosiąt, ze wskaźnikiem śmiertelności 100%, a także wykazywał wysoką patogenność u myszy.Badanie to jest pierwszym systematycznym badaniem dużej epidemii GETV w hodowlach świń w Henan, co wskazuje na zwiększoną wirulencję i właściwości molekularne wariantu GIII.

Wprowadzenie

Wirus Geta (GETV) to jednokątny wirus RNA o pozytywnym odczuciu, który zakaża szeroki zakres zwierząt i może nawet stanowić zagrożenie dla ludzi.wystąpiło skupione ognisko GETV w gospodarstwach handlowych w prowincji Henan,, w wyniku czego wyizolowano 27 szczepów. Wariant GIII był dominującym szczepem chorobotwórczym wykazującym zwiększoną wirulencję w porównaniu z wcześniejszymi szczepami.Badanie to stanowi odniesienie do zrozumienia molekularnej epidemiologii i patogenności GETV.

Materiały i metody

W tym badaniu wykorzystano komórki BHK-21 i PK-15 do hodowli izolatu HNJZ-S1 z GETV świń.Wykonanie wykrywania wirusa PCR/RT-PCRPozytywne próbki zostały wyizolowane, oczyszczone i zidentyfikowane w komórkach.i sekwencjonowane do wyrównania sekwencji i analizy filogenetycznej.

W eksperymentach na zwierzętach wstrzykiwało się wirusa do mięśni lub podskórnie świńom negatywnym dla wirusa GETV i dwudniowym myszom karmiącym się SPF. Obserwowano objawy kliniczne lub śmiertelność,i obciążenia wirusowe w krwi i tkankach. Wirusowe RNA zostało wyodrębnione z próbek tkanek, cDNA zostało zsyntezowane, a następnie wykryte za pomocą SYBR Green qPCR. Dane są przedstawiane jako średnie ± SD i analizowane przy użyciu GraphPad Prism 9.0.

Wyniki badań

1Zbieranie próbek i wykrywanie wirusów

W lipcu 2024 r. w gospodarstwie wieprzowcowym w Zhumadian w prowincji Henan wystąpiła epidemia z wysoką śmiertelnością u świnek w wieku od 3 do 10 dni, z częstotliwością zachorowalności 30% i śmiertelnością 80%.Potwierdzenie laboratoryjne wskazało, że wybuch wywołał jeden szczep GETVNastępnie podejrzenia o wystąpienie epidemii GETV pojawiły się w gospodarstwach wieprzowych w prowincji Henan.Zbiórka próbek klinicznych wykazała wystąpienie epidemii w 12 z 18 miast na poziomie prefektur oraz w 21 z 157 powiatów (rysunek 1 ((a))Od lipca do września odnotowano odpowiednio jedną, 15 i 16 epidemii. Głównymi objawami u prosiąt były ciężka biegunka, ataksja i osłabienie kończyn tylnych.Autopsie wykazały obrzęk i krwotok limfadenopatii, krwotoki płucne, rozproszone krwotoki powierzchniowe i obrzęk podskórny (rysunek 1(b)). Spośród 36 próbek dodatnich do GETV tylko dwie były współzakażone PDCoV, PCV2 lub JEV;pozostałe zostały zakażone jednym GETV (rysunek 1 ((c)).

Rysunek 1. Przegląd epidemii GETV w gospodarstwach wieprzowych w prowincji Henan

a) Rozmieszczenie gospodarstw wieprzowych z GETV w prowincji Henan. b) Brutalne zmiany histologiczne u zakażonych prosiąt podczas tego zarażenia.

c) identyfikacja PCR GETV i innych wirusów w próbkach tkanek.

Wniosek: zakażenie wirusem GETV wystąpiło u prosiąt w wielu gospodarstwach w prowincji Henan, głównie spowodowane jednym wirusem.z mieszanymi zakażeniami występującymi w kilku próbkach.

2. Wyizolowanie, identyfikacja i określenie tytułu GETV

Z 36 pozytywnych próbek, 28 szczepów GETV zostało z powodzeniem wyizolowanych w komórkach BHK-21. HNzk-XH1 i HNzmd-XP1 zostały zidentyfikowane jako GETV.znaczące zmiany cytopatyczneRT-PCR i mikroskopia elektroniczna potwierdziły identyfikację wirusa.Krzywy proliferacji wykazały, że kinetyka wzrostu obu szczepów wirusa była podobnaWyniki analizy płytek wykazały, że płytki obu szczepów wirusa były podobne pod względem wielkości, ale różniły się liczbą.

Rysunek 2. Wyizolowanie i charakterystyka GETV

(A) Po zakażeniu komórek BHK-21 i PK-15 HNzk- XH1 lub HNzmd- XP1 w ciągu 12 do 36 godzin zaobserwowano działania cytopatyczne.

(B) Izolaty GETV zostały zidentyfikowane za pomocą RT-PCR. (C) Morfologia cząstek GETV została zbadana za pomocą mikroskopii elektronicznej.

(d) Wzrost HNzk-XH1 lub HNzmd-XP1 w komórkach BHK-21 i PK-15. (e) Morfologia płytek GETV na komórkach BHK-21.

Wniosek: szczepy GETV HNzk-XH1 i HNzmd-XP1 zostały z powodzeniem wyizolowane z próbek hodowli świń.o podobnej kinetyce wzrostu i zmianach tytułu, ale z różnicami w liczbie płytek.

3Sekwencjonowanie i analiza filogenetyczna

Sekwencje całego genomu (numery przystąpienia do GenBank: PQ658739?? PQ658750) i sekwencje genów E2 (numery przystąpienia do GenBank: PQ658751?? PQ658766) uzyskane w tym badaniu zostały przedłożone do GenBank.Analiza homologii całego genomu wykazała, że tożsamość nukleotydów wśród izolatów wahała się od 98W porównaniu ze szczepem referencyjnym, tożsamość nukleotydów tych izolatów z GI, GII, GIV i GIII wynosiła 94,8% – 95,0%, 96Identyfikaty aminokwasów wynosiły odpowiednio 98,5%98,8%, 98,9%99,1%, 98,3%99,5% i 98,7%100,0%.

Analiza filogenetyczna oparta na genach E2 28 izolatów i 12 całych genomów wykazała, że wszystkie izolaty należały do GIII, odlegle spokrewnione z innymi grupami (rysunek 3 ((a, b)).Większość z nich skupiała się z wariantem GDHYLC23 (rysunek 3 ((b)). Wyporządkowanie sekwencji aminokwasów wykazało cztery wyjątkowe mutacje w białkach nsP3 i E2 tych izolatów (rysunek 3 ((c)).mutacje A381T i V503G znajdują się w regionie HVD, a białko E2 ma mutację D323E w pozycji 323. Na podstawie tych cech, izolaty w tym kladzie zostały zidentyfikowane jako warianty GIII.

Rysunek 3. Analiza filogenetyczna i wyrównanie sekwencji aminokwasów izolatów. Analiza filogenetyczna izolatów na podstawie E2 (a) i kompletnego genomu (b).

Wniosek: Wszystkie izolaty w tym badaniu należą do genotypu GIII, odlegle spokrewnionych z innymi genotypami i posiadają unikalne mutacje aminokwasów w białkach nsP3 i E2,potwierdzające, że te izolaty są wariantami GIII.

4Patogenność szczepu GETV HNzk-XH1 u prosiąt

Ze względu na wysoki wskaźnik śmiertelności w wyniku ogniska GETV w gospodarstwach wieprzowych i wysoki poziom wirusów GETV wyizolowanych z komórek BHK-21 i PK-15,szczep HNzk-XH1 o wyższym tyterze został wybrany do oceny patogenności w tym badaniuŚwinki w grupie testowej otrzymywały do mięśni zastrzyk 107TCID50 ze szczepu HNzk-XH1, podczas gdy grupa kontrolna otrzymywała taką samą ilość środka DMEM.24 godziny po wyzwaniuPo dwóch dniach niektóre prosiaki zmarły, a w ciągu czterech dni wszystkie prosiaki zmarły.osiągając 100% wskaźnik śmiertelności (rysunek 4 (c))Wyniki klinicznych objawów wykazały, że grupa HNzk-XH1 miała znacznie cięższe objawy niż grupa kontrolna (rysunek 4 (b)).podczas gdy grupa kontrolna została poddana autopsji 8 dni późniejŚciana jelita cienkiego w grupie HNzk-XH1 była znacząco rozcieńczona, z żółtą, wodną zawartością, podczas gdy jelita cienkie w grupie kontrolnej były normalne (rysunek 4 (a)).Analiza RT-qPCR wykazała, że liczba kopii genu GETV nsP1 w krwi pobranej dwa dni po wykonaniu badania była bliska 106/ mlBadania wątroby, płuc, nerek, śledziony, jelita cienkiego,w tkankach mózgu prosiąt wykazano wysokie obciążenie wirusowe we wszystkich narządach grupy zakażonej HNzk- XH1, podczas gdy w grupie kontrolnej nie wykryto żadnego RNA GETV (rys. 4 (e)).

Rysunek 4. Patogenność u prosiąt

a) Objawy kliniczne i wyniki autopsji zakażonych prosiąt. b) Wyniki kliniczne zakażonych prosiąt.

d) Poziom wirusowego RNA w całkowitej krwi zainfekowanych prosiąt w dniu 2 po zakażeniu.

e) Poziom wirusowego RNA w różnych narządach prosiąt, które zmarły lub zostały poddane eutanazji po zakażeniu.

Wniosek: szczep HNzk-XH1 jest wysoce chorobotwórczy dla prosiąt, szybko powodując ciężkie objawy kliniczne i śmiertelność.W grupie kontrolnej nie zaobserwowano żadnych nieprawidłowości..

5Zmiany patologiczne u myszy karmiących, zakażonych odmianą HNzk-XH1

Badanie to pokazuje, że myszy karmiące piersią są idealnym modelem do badania wirulencji GETV.Wyniki eksperymentalne wykazały, że zakażenie szczurów karmiących wirusem HNzk-XH1 powodowało paraliż kończyn tylnych i upośledzenie wzrostu (rysunek 5 ((a))W przeciwieństwie do tego szczep HNZJ-S1 był mniej śmiertelny, a myszy karmiące, zakażone niskimi dawkami, przeżyły i zyskały normalną wagę.wskazujące na istotną różnicę w patogenności obu szczepów u myszy karmiących.

Rysunek 5. Porównanie patogenności HNzk-XH1 i HNZJ-S1

(a) Objawy kliniczne zakażenia u myszy karmiących. (b) Współczynnik przeżycia myszy karmiących zakażonych różnymi dawkami szczepu HNzk-XH1.

(c) Współczynnik przeżycia myszy karmiących, zakażonych różnymi dawkami szczepu HNZJ-S1. (d) Zmiany masy myszy karmiących, zakażonych różnymi dawkami szczepu HNzk-XH1.

e) Zmiany masy myszy karmiących, zakażonych różnymi dawkami szczepu HNZJ-S1.

Wniosek: HNzk-XH1 jest wysoce chorobotwórczy u myszy karmiących, powodując paraliż kończyn tylnych, opóźnienie wzrostu i szybką śmierć.i myszy karmiące, które zostały zainfekowane niskimi dawkami, przetrwały i utrzymały normalną masę ciała., co wskazuje na istotną różnicę w wirulencji między tymi dwoma szczepami.

Wniosek

Badanie to wykazało, że ognisko GETV w gospodarstwach wieprzowych w prowincji Henan w okresie od lipca do września 2024 r. zostało zidentyfikowane jako niezależny, rozgałęziony wariant grupy GIII,zawierające cztery wyjątkowe mutacje aminokwasów w białkach E2 i nsP3W porównaniu z wcześniejszymi odmianami, ten wariant wykazuje zwiększoną wirulencję i może być po cichu przenoszony przez świnie i komary przed epidemią.Warunki klimatyczne i ruch w gospodarstwach wieprzowych przyspieszyły rozprzestrzenianie się epidemiiObecnie w Chinach nie ma dostępnej szczepionki, co wymaga zwiększonej obserwacji i terminowych dostosowań strategii zapobiegania i kontroli.