Unternehmensnachrichten über Neueste Forschungsergebnisse. Prävalenz von GIII-Getavirus-Varianten mit erhöhter Virulenz in Schweinefarmen in der Provinz Henan.

Das Geta-Virus (GETV) ist ein neu auftretendes, durch Moskitos übertragenes Virus, das eine Vielzahl von Tieren und Menschen bedroht. Von Juli bis September 2024 kam es in Schweinefarmen in der Provinz Henan zu einem konzentrierten GETV-Ausbruch, der einen der weitverbreitetsten und konzentriertesten Ausbrüche in Festlandchina in den letzten Jahren darstellte.

Von Juli bis September 2024 kam es in mehreren Schweinefarmen in der Provinz Henan zu einem konzentrierten Ausbruch des Geta-Virus (GETV). Siebenundzwanzig Stämme wurden aus 31 Schweinefarmen isoliert, von denen 22 in der phylogenetischen Analyse einen einzigartigen Cluster bildeten und Aminosäuremutationen in den nsP3- und E2-Proteinen aufwiesen.

Experimente zeigten, dass diese GIII-Variante eine signifikant erhöhte Pathogenität bei Ferkeln aufwies, mit einer Letalitätsrate von 100 %, und auch bei Mäusen eine hohe Pathogenität zeigte. Diese Studie ist die erste systematische Untersuchung eines groß angelegten GETV-Ausbruchs in Schweinefarmen in Henan und zeigt die erhöhte Virulenz und die molekularen Eigenschaften der GIII-Variante auf.

Einleitung

Das Geta-Virus (GETV) ist ein einzelsträngiges, positiv-sense RNA-Virus, das eine Vielzahl von Tieren infiziert und sogar eine Bedrohung für den Menschen darstellen kann. Von Juli bis September 2024 kam es in kommerziellen Schweinefarmen in der Provinz Henan zu einem konzentrierten GETV-Ausbruch, der zur Isolierung von 27 Stämmen führte. Die GIII-Variante war der vorherrschende pathogene Stamm und wies im Vergleich zu früheren Stämmen eine erhöhte Virulenz auf. Diese Studie liefert eine Referenz für das Verständnis der molekularen Epidemiologie und Pathogenität von GETV.

Materialien und Methoden

In dieser Studie wurden BHK-21- und PK-15-Zellen verwendet, um den porcinen GETV-Isolat HNJZ-S1 zu kultivieren. Virale Nukleinsäure wurde aus verdächtigen infizierten Schweinefarmen in Henan und Shanxi extrahiert und cDNA synthetisiert. Der Virusnachweis erfolgte durch PCR/RT-PCR. Positive Proben wurden in Zellen isoliert, gereinigt und identifiziert. Die Wachstumseigenschaften und die Plaquebildung des Virus wurden bestimmt. Das E2-Gen und das gesamte Genom wurden amplifiziert, kloniert und sequenziert, um eine Sequenzausrichtung und phylogenetische Analyse durchzuführen.

In Tierversuchen wurden GETV-negative Ferkel und zweitägige SPF-Säuglingsmäuse intramuskulär oder subkutan mit dem Virus injiziert. Klinische Anzeichen oder die Mortalität wurden beobachtet, und die Viruslast in Blut und Gewebe wurde gemessen. Virale RNA wurde aus Gewebeproben extrahiert, cDNA synthetisiert und dann durch SYBR Green qPCR nachgewiesen. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt und mit GraphPad Prism 9.0 analysiert.

Forschungsergebnisse

1. GETV-Probenentnahme und Virusnachweis

Im Juli 2024 kam es in einer Schweinefarm in Zhumadian, Provinz Henan, zu einem Ausbruch mit hoher Mortalität bei 3 bis 10 Tage alten Ferkeln, mit einer Morbiditätsrate von 30 % und einer Mortalitätsrate von 80 %. Laborbestätigungen zeigten, dass der Ausbruch durch einen einzelnen GETV-Stamm verursacht wurde. Anschließend kam es in Schweinefarmen in der gesamten Provinz Henan zu vermuteten GETV-Ausbrüchen. Die Entnahme klinischer Proben ergab Ausbrüche in 12 von 18 Präfekturstädten und 21 von 157 Landkreisen (Abbildung 1(a)). Von Juli bis September gab es einen, 15 bzw. 16 Ausbrüche. Die Hauptsymptome bei Ferkeln waren schwerer Durchfall, Ataxie und Schwäche der Hinterbeine. Autopsien zeigten geschwollene und hämorrhagische Lymphadenopathie, Lungenblutungen, verstreute oberflächliche Blutungen und subkutane Ödeme (Abbildung 1(b)). Von den 36 GETV-positiven Proben waren nur zwei mit PDCoV, PCV2 oder JEV koinfiziert; die restlichen waren mit einem einzelnen GETV infiziert (Abbildung 1(c)).

Abbildung 1. Übersicht über den GETV-Ausbruch in Schweinefarmen in der Provinz Henan

(a) Verteilung der GETV-positiven Schweinefarmen in der Provinz Henan. (b) Bruttogewebliche Läsionen bei infizierten Ferkeln während dieses Ausbruchs.

(c) PCR-Identifizierung von GETV und anderen Viren in Gewebeproben.

Schlussfolgerung: GETV-Infektionen traten bei Ferkeln in mehreren Farmen in der Provinz Henan auf, hauptsächlich verursacht durch ein einzelnes Virus. Zu den klinischen Manifestationen gehörten Durchfall, Ataxie und Schwäche der Hinterbeine, wobei Mischinfektionen in einigen wenigen Proben auftraten.

2. Isolierung, Identifizierung und Titerbestimmung von GETV

Aus 36 positiven Proben wurden 28 GETV-Stämme erfolgreich in BHK-21-Zellen isoliert. HNzk-XH1 und HNzmd-XP1 wurden als GETV identifiziert. Nach 48 Stunden Infektion in BHK-21- oder PK-15-Zellen wurden im Vergleich zu den Kontrollen signifikante zytopathische Veränderungen beobachtet, darunter Zellschrumpfung, -rundung und -ablösung. RT-PCR und Elektronenmikroskopie bestätigten die virale Identität weiter. Die Proliferationskurven zeigten, dass die Wachstumskinetik der beiden Virusstämme ähnlich war, wobei die Titer 36 Stunden nach der Infektion einen Peak erreichten und dann abnahmen. Die Ergebnisse des Plaque-Assays zeigten, dass die Plaques der beiden Virusstämme in ihrer Größe ähnlich waren, sich aber in ihrer Anzahl unterschieden.

Abbildung 2. Isolierung und Charakterisierung von GETV

(A) Nach der Infektion von BHK-21- und PK-15-Zellen mit HNzk-XH1 oder HNzmd-XP1 wurden innerhalb von 12 bis 36 Stunden zytopathische Effekte beobachtet.

(B) GETV-Isolate wurden durch RT-PCR identifiziert. (C) Die Partikelmorphologie von GETV wurde durch Elektronenmikroskopie untersucht.

(d) Wachstum von HNzk-XH1 oder HNzmd-XP1 in BHK-21- und PK-15-Zellen. (e) Plaque-Morphologie von GETV auf BHK-21-Zellen.

Schlussfolgerung: Die GETV-Stämme HNzk-XH1 und HNzmd-XP1 wurden erfolgreich aus Proben von Schweinefarmen isoliert. Beide Stämme verursachten signifikante zytopathische Effekte in Zellen, mit ähnlicher Wachstumskinetik und Titerveränderungen, aber mit Unterschieden in der Anzahl der Plaques.

3. Sequenzierung und phylogenetische Analyse

Die in dieser Studie erhaltenen Gesamtgenomsequenzen (GenBank-Zugangsnummern: PQ658739–PQ658750) und E2-Gensequenzen (GenBank-Zugangsnummern: PQ658751–PQ658766) wurden bei GenBank eingereicht. Die Homologieanalyse des gesamten Genoms zeigte, dass die Nukleotididentität zwischen den Isolaten zwischen 98,4 % und 100,0 % lag und die Aminosäureidentität zwischen 99,3 % und 100,0 %. Im Vergleich zum Referenzstamm betrug die Nukleotididentität dieser Isolate mit GI, GII, GIV und GIII 94,8 %–95,0 %, 96,9 %–97,0 %, 95,6 %–97,3 % bzw. 96,9 %–99,8 %. Die Aminosäureidentitäten betrugen 98,5 %–98,8 %, 98,9 %–99,1 %, 98,3 %–99,5 % bzw. 98,7 %–100,0 %.

Die phylogenetische Analyse basierend auf den E2-Genen von 28 Isolaten und 12 Gesamtgenomen ergab, dass alle Isolate zu GIII gehörten, die entfernt mit anderen Gruppen verwandt waren (Abbildung 3(a,b)). Die meisten von ihnen gruppierten sich mit der GDHYLC23-Variante (Abbildung 3(b)). Die Aminosäuresequenzausrichtung ergab vier einzigartige Mutationen in den nsP3- und E2-Proteinen dieser Isolate (Abbildung 3(c)). Die nsP3 P329S-Mutation befindet sich in der ZBD-Region, die A381T- und V503G-Mutationen befinden sich in der HVD-Region, und das E2-Protein weist eine D323E-Mutation an Position 323 auf. Basierend auf diesen Merkmalen wurden die Isolate in dieser Klade als GIII-Varianten identifiziert.

Abbildung 3. Phylogenetische Analyse und Aminosäuresequenzausrichtung der Isolate. Phylogenetische Analyse der Isolate basierend auf E2 (a) und vollständigem Genom (b).

Schlussfolgerung: Die Isolate in dieser Studie gehören alle zum GIII-Genotyp, sind entfernt mit anderen Genotypen verwandt und weisen einzigartige Aminosäuremutationen in den nsP3- und E2-Proteinen auf, was bestätigt, dass diese Isolate GIII-Varianten sind.

4. Pathogenität des GETV HNzk-XH1-Stamms bei Ferkeln

Aufgrund der hohen Mortalitätsrate von GETV-Ausbrüchen in kommerziellen Schweinefarmen und der hohen Titer von GETV-Viren, die aus BHK-21- und PK-15-Zellen isoliert wurden, wurde der höher titrierte HNzk-XH1-Stamm für die Pathogenitätsbewertung in dieser Studie ausgewählt. Ferkel in der Challenge-Gruppe wurden intramuskulär mit 10⁷TCID₅₀ des HNzk-XH1-Stamms injiziert, während die Kontrollgruppe mit dem gleichen Volumen DMEM-Medium injiziert wurde. Vierundzwanzig Stunden nach der Challenge entwickelten Ferkel in der Challenge-Gruppe Durchfall, gefolgt von Hinterbeinlähmung 1,5 Tage später. Zwei Tage später starben einige Ferkel, und innerhalb von vier Tagen waren alle Ferkel gestorben, was einer Mortalitätsrate von 100 % entsprach (Abbildung 4(c)). Klinische Symptomwerte zeigten, dass die HNzk-XH1-Gruppe signifikant schwerere Symptome aufwies als die Kontrollgruppe (Abbildung 4(b)). Tote Ferkel wurden sofort autopsiert, während die Kontrollgruppe 8 Tage später autopsiert wurde. Die Dünndarmwand der HNzk-XH1-Gruppe war signifikant verdünnt, mit gelbem, wässrigem Inhalt, während der Dünndarm der Kontrollgruppe normal war (Abbildung 4(a)). Die RT-qPCR-Analyse ergab, dass die GETV nsP1-Genkopienzahl im Blut, das zwei Tage nach der Challenge entnommen wurde, nahe bei 10⁶/ml lag, während in der Kontrollgruppe kein Virus nachgewiesen wurde (Abbildung 4(d)). Die Untersuchung der Leber, Lunge, Niere, Milz, des Dünndarms und des Gehirngewebes der Ferkel ergab hohe Viruslasten in allen Organen der mit HNzk-XH1 infizierten Gruppe, während in der Kontrollgruppe keine GETV-RNA nachgewiesen wurde (Abbildung 4(e)).

Abbildung 4. Pathogenität bei Ferkeln

(a) Klinische Anzeichen und Autopsieergebnisse infizierter Ferkel. (b) Klinische Werte infizierter Ferkel.

(c) Überlebensrate infizierter Ferkel. (d) Virus-RNA-Spiegel im Vollblut infizierter Ferkel am Tag 2 nach der Infektion.

(e) Virus-RNA-Spiegel in verschiedenen Organen von Ferkeln, die nach der Infektion starben oder euthanasiert wurden.

Schlussfolgerung: Der HNzk-XH1-Stamm ist hochpathogen für Ferkel und verursacht schnell schwere klinische Symptome und Mortalität. Das Virus ist im Blut und in den wichtigsten Organen weit verbreitet. In der Kontrollgruppe wurden keine Anomalien beobachtet.

5. Pathologische Veränderungen bei Säuglingsmäusen, die mit der HNzk-XH1-Variante infiziert wurden

Diese Studie zeigt, dass Säuglingsmäuse ein ideales Modell für die Untersuchung der Virulenz von GETV sind. Die experimentellen Ergebnisse zeigten, dass die Infektion von Säuglingsmäusen mit der HNzk-XH1-Variante zu Hinterbeinlähmung und Wachstumsverzögerung führte (Abbildung 5(a)) und bei unterschiedlichen Dosen zum schnellen Tod führte. Im Gegensatz dazu war der HNZJ-S1-Stamm weniger letal, und Säuglingsmäuse, die mit niedrigen Dosen infiziert wurden, überlebten und nahmen normal an Gewicht zu, was darauf hindeutet, dass es einen signifikanten Unterschied in der Pathogenität der beiden Stämme bei Säuglingsmäusen gab.

Abbildung 5. Vergleich der Pathogenität von HNzk-XH1 und HNZJ-S1

(a) Klinische Symptome der Infektion bei Säuglingsmäusen. (b) Überlebensrate von Säuglingsmäusen, die mit unterschiedlichen Dosen des HNzk-XH1-Stamms infiziert wurden.

(c) Überlebensrate von Säuglingsmäusen, die mit unterschiedlichen Dosen des HNZJ-S1-Stamms infiziert wurden. (d) Gewichtsveränderungen von Säuglingsmäusen, die mit unterschiedlichen Dosen des HNzk-XH1-Stamms infiziert wurden.

(e) Gewichtsveränderungen von Säuglingsmäusen, die mit unterschiedlichen Dosen des HNZJ-S1-Stamms infiziert wurden.

Schlussfolgerung: Die HNzk-XH1-Variante ist hochpathogen bei Säuglingsmäusen und verursacht Hinterbeinlähmung, Wachstumsverzögerung und schnellen Tod. Der HNZJ-S1-Stamm ist weniger pathogen, und Säuglingsmäuse, die mit niedrigen Dosen infiziert wurden, überleben und behalten ihr normales Körpergewicht, was auf einen signifikanten Unterschied in der Virulenz zwischen den beiden Stämmen hindeutet.

Schlussfolgerung

Diese Studie zeigt, dass der GETV-Ausbruch in Schweinefarmen in der Provinz Henan von Juli bis September 2024 als eine unabhängige, verzweigende Variante der GIII-Gruppe identifiziert wurde, die vier einzigartige Aminosäuremutationen in den E2- und nsP3-Proteinen aufweist. Im Vergleich zu früheren Isolaten weist diese Variante eine erhöhte Virulenz auf und könnte vor dem Ausbruch stillschweigend durch Schweine und Moskitos übertragen worden sein. Klimabedingungen und Zirkulationsmuster in Schweinefarmen beschleunigten die Ausbreitung der Epidemie. Derzeit ist in China kein Impfstoff verfügbar, was eine verstärkte Überwachung und rechtzeitige Anpassungen der Präventions- und Kontrollstrategien erforderlich macht.