اخبار شرکت به اشتراک گذاری آخرین تحقیقات | شیوع انواع ژنوتیپ GIII ویروس گاستروانتریت در مزارع خوک در استان هنان

ویروس گتا (GETV) یک ویروس جدید است که توسط پشه منتقل می شود و طیف گسترده ای از حیوانات و انسان ها را تهدید می کند. از ژوئیه تا سپتامبر 2024,شیوع متمرکز GETV در مزرعه های خوک در سراسر استان هنان رخ داده است.، یکی از گسترده ترین و متمرکزترین شیوع ها در سرزمین اصلی چین در سال های اخیر است.

از ژوئیه تا سپتامبر سال 2024، شیوع متمرکز ویروس گتا (GETV) در چندین مزرعه خوک در استان هنان رخ داد. بیست و هفت گونه از 31 مزرعه خوک جدا شد،۲۲ مورد از آن ها یک خوشه ی منحصر به فرد در درخت فیلوژنیتیک تشکیل داده و جهش های اسید آمینه ای در پروتئین های nsP3 و E2 را نشان داده اند..

آزمایشات نشان داد که این نوع GIII به طور قابل توجهی بیماری زا در خوک ها، با نرخ مرگ و میر 100٪، و همچنین بیماری زا در موش ها را نشان می دهد.این مطالعه اولین تحقیق سیستماتیک در مورد شیوع بزرگ GETV در مزارع خوک های هنان است، نشان دهنده افزایش ویروس شناسی و ویژگی های مولکولی نوع GIII است.

مقدمه

ویروس گتا (GETV) یک ویروس RNA یک رشته ای با حس مثبت است که طیف گسترده ای از حیوانات را آلوده می کند و حتی ممکن است برای انسان تهدیدی ایجاد کند. از ژوئیه تا سپتامبر 2024,شیوع متمرکز GETV در مزرعه های خوک تجاری در استان هنان رخ داده است، که منجر به جداسازی 27 سویه شد. نوع GIII سویه بیماری زا غالب بود و در مقایسه با سویه های قبلی ویروس پذیری بیشتری را نشان می داد.این مطالعه برای درک اپیدمیولوژی مولکولی و بیماری زا بودن GETV یک مرجع ارائه می دهد..

مواد و روش ها

در این مطالعه از سلول های BHK-21 و PK-15 برای کشت جداکننده GETV خوک HNJZ-S1 استفاده شد. اسید نوکلئیک ویروسی از مزرعه های خوک آلوده مشکوک در هنان و شانسی استخراج شد و cDNA ترکیب شد.تشخیص ویروس با PCR/RT-PCR انجام شدنمونه های مثبت جدا شده، تصفیه شده و در سلول ها شناسایی شده اند. ویژگی های رشد ویروسی و تشکیل پلاک تعیین شده است. ژن E2 و کل ژنوم تقویت شده، شبیه سازی شده،و برای هماهنگی توالی و تجزیه و تحلیل فیلوژنیتیک توالی شده است.

در آزمایشات حیوانی، خوک های منفی GETV و موش های شیرخوار دو روزه SPF به صورت عضلانی یا زیر پوست با ویروس تزریق شدند. علائم بالینی یا مرگ و میر مشاهده شد،و بار ویروسی در خون و بافت اندازه گیری شد.RNA ویروسی از نمونه های بافت استخراج شد، cDNA ترکیب شد و سپس توسط SYBR Green qPCR شناسایی شد. داده ها به عنوان میانگین ± SD ارائه شده و با استفاده از گراف پد پریزم 9 تجزیه و تحلیل شده است.0.

نتایج تحقیقات

1جمع آوری نمونه و تشخیص ویروس

در ژوئیه سال 2024، شیوع مرگ و میر بالا در خوک های 3 تا 10 روزه در یک مزرعه خوک در ژومادیان، استان هنان، با میزان بیماری 30٪ و میزان مرگ و میر 80٪ رخ داد.تایید آزمایشگاهی نشان داد که شیوع توسط یک سویه GETV ایجاد شده است.بعد از آن، شیوع مشکوک GETV در مزارع خوک در سراسر استان هنان رخ داد.جمع آوری نمونه های بالینی شیوع را در 12 شهر از 18 شهر در سطح ولایت و 21 شهر از 157 شهرستان نشان داد (شکل 1 ((a))از ژوئیه تا سپتامبر، به ترتیب یک، 15 و 16 شیوع وجود داشت. علائم اصلی در خوک ها اسهال شدید، آتکسیا و ضعف اندام های عقب بود.کالبد شکافی نشان داد که لیمفادونوپاتی ورم و خونریزی دارد، خونریزی ریوی، خونریزی سطحی پراکنده و ورم زیر پوست (شکل 1 ((ب)). از 36 نمونه مثبت GETV، تنها دو مورد با PDCoV، PCV2 یا JEV آلوده شدند.باقیمانده با یک GETV آلوده شده اند (شکل 1 ((c)).

نمودار ۱. خلاصه شیوع GETV در مزرعه خوک در استان هنان

(الف) توزیع مزرعه خوک های مثبت GETV در استان هنان. (ب) ضایعات هیستولوژیکی ناخالص در خوک های آلوده در طول این شیوع.

ج) شناسایی PCR GETV و سایر ویروس ها در نمونه های بافت.

نتیجه گیری: عفونت GETV در خوک ها در چندین مزرعه در استان هنان رخ داده است، که عمدتا توسط یک ویروس واحد ایجاد شده است.با عفونت های مختلط در چند نمونه.

2جداسازی، شناسایی و تعیین عنوان GETV

از ۳۶ نمونه مثبت، ۲۸ گونه GETV با موفقیت در سلول های BHK-۲۱ جدا شدند. HNzk-XH1 و HNzmd-XP1 به عنوان GETV شناسایی شدند. پس از ۴۸ ساعت عفونت در سلول های BHK-۲۱ یا PK-۱۵،تغییرات سایتوپاتیک قابل توجهی، از جمله کوچک شدن سلول ها، گرد شدن و پوسته شدن، در مقایسه با کنترل ها مشاهده شد. RT-PCR و میکروسکوپی الکترونی همچنین هویت ویروسی را تأیید کردند.منحنی های تکثیر نشان داد که حرکات رشد دو سویه ویروس مشابه بودند.نتایج آزمایش پلاک نشان داد که پلاک های دو سویه ویروس از نظر اندازه مشابه بودند، اما تعداد آنها متفاوت بود.

نمودار ۲: جداسازی و توصیف GETV

(A) پس از عفونت سلول های BHK- 21 و PK- 15 با HNzk- XH1 یا HNzmd- XP1، اثرات سایتوپاتیک در عرض 12 تا 36 ساعت مشاهده شد.

(ب) جداکننده های GETV با RT-PCR شناسایی شدند. (ج) مورفولوژی ذرات GETV با میکروسکوپی الکترونی بررسی شد.

(د) رشد HNzk-XH1 یا HNzmd-XP1 در سلول های BHK-21 و PK-15. (ه) مورفولوژی پلاک GETV در سلول های BHK-21.

نتیجه گیری: سویه های GETV HNzk-XH1 و HNzmd-XP1 با موفقیت از نمونه های مزرعه خوک جدا شدند. هر دو سویه اثرات سایتوپاتیک قابل توجهی در سلول ها ایجاد کردند.با حرکات رشد مشابه و تغییرات تیتری، اما با تفاوت در تعداد پلاک

3توالی و تجزیه و تحلیل فایلوجنیتیک

توالی های کل ژنوم (رقم پیوستن GenBank: PQ658739 PQ658750) و توالی های ژن E2 (رقم پیوستن GenBank: PQ658751 PQ658766) که در این مطالعه به دست آمده اند به GenBank ارسال شده است.تجزیه و تحلیل همولوژی کل ژنوم نشان داد که هویت نوکلئوتید در بین جداکننده ها از 98 تا 98 درصد است..4٪ تا 100.0٪ و هویت اسید آمینه از 99.3٪ تا 100.0٪ بود. در مقایسه با سویه مرجع، هویت نوکلئوتید این جداکننده ها با GI، GII، GIV و GIII 94.8٪ ٪ 95.0٪ بود. 96.9٪ ٪97.0٪ ، 95.6٪ ٪97.3٪ و 96.9٪ ٪99.8٪ ، به ترتیب. هویت اسید آمینه به ترتیب 98.5٪ ٪98.8٪ ، 98.9٪ ٪99.1٪ ، 98.3٪ ٪99.5٪ و 98.7٪ ٪100.0٪ بود.

تجزیه و تحلیل فیلوژنیتیک بر اساس ژن های E2 از 28 جدا کننده و 12 ژنوم کامل نشان داد که همه جداکننده ها متعلق به GIII هستند، که با گروه های دیگر فاصله دارند (شکل 3 ((a،b)).بیشتر آنها با نوع GDHYLC23 گروه بندی شده اند (شکل 3 ((ب))تراز تسلسل اسید آمینه چهار جهش منحصر به فرد را در پروتئین nsP3 و E2 این عایق ها نشان داد (شکل 3 ((c)). جهش nsP3 P329S در منطقه ZBD واقع شده است،جهش های A381T و V503G در منطقه HVD قرار دارند.، و پروتئین E2 دارای جهش D323E در موقعیت 323 است. بر اساس این ویژگی ها، جداکننده های این دسته به عنوان انواع GIII شناسایی شدند.

شکل ۳. تجزیه و تحلیل فیلوژنیتیک و تراز تسلسل اسید آمینه ای از جداکننده ها. تجزیه و تحلیل فیلوژنیتیک از جداکننده ها بر اساس E2 (a) و ژنوم کامل (b).

نتیجه گیری: جداکننده های این مطالعه همگی متعلق به ژنوتایپ GIII هستند که با سایر ژنوتایپ ها ارتباط دور دارند و جهش آمینو اسید منحصر به فرد در پروتئین های nsP3 و E2 دارند.تایید اینکه این جداکننده ها گونه های GIII هستند.

4بیماری زا بودن گونه GETV HNzk-XH1 در خوک ها

با توجه به میزان مرگ و میر بالای شیوع GETV در مزارع خوک تجاری و تیترهای بالای ویروس های GETV جدا شده از سلول های BHK-21 و PK-15،گونه HNzk-XH1 با تیتری بالاتر برای ارزیابی بیماری زا در این مطالعه انتخاب شد.خوک ها در گروه چالش با 107TCID50 از سویه HNzk-XH1 از طریق عضلانی تزریق شدند، در حالی که گروه کنترل با حجم مساوی از DMEM تزریق شد.بیست و چهار ساعت بعد از چالش، خوک ها در گروه چالش اسهال ایجاد کردند و بعد از یک روز و نیم فلج اندام های عقب. دو روز بعد، برخی از خوک ها مردند و در عرض چهار روز همه خوک ها مردند.به میزان مرگ و میر 100 درصد می رسد (شکل 4 ((c))نمرات علائم بالینی نشان داد که گروه HNzk-XH1 به طور قابل توجهی علائم شدیدتری نسبت به گروه کنترل داشتند (شکل 4 ((ب)).در حالی که گروه کنترل 8 روز بعد کالبد شکافی انجام شددیواره روده کوچک گروه HNzk-XH1 به طور قابل توجهی رقیق شده بود، با محتوای زرد و آبی، در حالی که روده کوچک گروه کنترل طبیعی بود (شکل 4 ((a)).تجزیه و تحلیل RT-qPCR نشان داد که تعداد کپی ژن GETV nsP1 در خون جمع آوری شده دو روز پس از آزمایش نزدیک به 106 / ml بود.، در حالی که هیچ ویروس در گروه کنترل شناسایی نشد (شکل 4 ((d)).و بافت های مغزی خوک ها بار ویروسی بالایی در تمام اندام های گروه آلوده به HNzk-XH1 نشان دادند.، در حالی که هیچ RNA GETV در گروه کنترل شناسایی نشد (شکل 4 ((e)).

شکل ۴. بیماری زا بودن در خوک ها

(الف) علائم بالینی و نتایج کالبد شکافی خوک های آلوده. (ب) نمرات بالینی خوک های آلوده.

ج) میزان بقای خوک های آلوده. د) میزان RNA ویروسی در خون کامل خوک های آلوده در روز دوم پس از عفونت.

(ه) میزان RNA ویروسی در اندام های مختلف خوک های مرده یا بعد از عفونت از بین رفته است.

نتیجه گیری: سویه HNzk-XH1 برای خوک ها بسیار بیماری زا است و به سرعت باعث علائم بالینی شدید و مرگ و میر می شود. این ویروس به طور گسترده ای در خون و اندام های اصلی وجود دارد.هیچ گونه ناهنجاری در گروه کنترل مشاهده نشد..

5تغییرات پاتولوژیکی در موش های شیرده مبتلا به نوع HNzk-XH1

این مطالعه نشان می دهد که موش های شیرده یک مدل ایده آل برای مطالعه ویروس GETV هستند.نتایج آزمایش نشان داد که عفونت موش های شیرده با نوع HNzk-XH1 باعث فلج اندام های عقب و کاهش رشد می شود (شکل 5 ((a))در مقابل، سویه HNZJ-S1 کمتر کشنده بود، و موش های شیرده که با دوز های پایین آلوده شده بودند زنده ماندند و وزن طبیعی به دست آوردند،که نشان می دهد تفاوت قابل توجهی در بیماری زا بودن این دو گونه در موش های شیرده وجود دارد.

شکل ۵. مقایسه بیماری زا بودن HNzk-XH1 و HNZJ-S1

a) علائم بالینی عفونت در موش های شیرده شده. b) میزان زنده ماندن موش های شیرده شده مبتلا به دوز های مختلف سویه HNzk-XH1.

(ج) میزان زنده ماندن موش های شیرده شده مبتلا به دوز های مختلف سویه HNZJ-S1. (د) تغییرات وزن موش های شیرده شده مبتلا به دوز های مختلف سویه HNzk-XH1.

(ه) تغییرات وزن موش های شیرده که با دوز های مختلف از سویه HNZJ-S1 آلوده شده اند.

نتیجه گیری: نوع HNzk-XH1 در موش های شیرده بسیار بیماری زا است و باعث فلج اندام های عقب، کند شدن رشد و مرگ سریع می شود.و موش های شیرده که با دوز پایین آلوده شده اند زنده می مانند و وزن طبیعی بدن را حفظ می کنند.، که نشان دهنده تفاوت قابل توجهی در ویروس بین دو سویه است.

نتیجه گیری

این مطالعه نشان می دهد که شیوع GETV در مزارع خوک در استان هنان از ژوئیه تا سپتامبر 2024 به عنوان یک نوع مستقل و شاخه دار از گروه GIII شناسایی شده است.دارای چهار جهش آمینو اسید منحصر به فرد در پروتئین های E2 و nsP3در مقایسه با جداسازی های قبلی، این نوع از ویروس بیشتر است و ممکن است قبل از شیوع از طریق خوک ها و پشه ها منتقل شده باشد.شرایط آب و هوایی و الگوهای گردش از مزرعه خوک گسترش اپیدمی را تسریع کرددر حال حاضر، هیچ واکسن در چین موجود نیست، که نیاز به نظارت بیشتر و تنظیمات به موقع در استراتژی های پیشگیری و کنترل دارد.