εταιρικά νέα για Τελευταία Κοινοποίηση Έρευνας | Επικράτηση Παραλλαγών Γενότυπου GIII Getavirus με Ενισχυμένη Ιογένεση σε Χοιροτροφικές Μονάδες στην Επαρχία Χενάν

Ο ιός Geta (GETV) είναι ένας αναδυόμενος ιός που μεταδίδεται από κουνούπια και απειλεί ένα ευρύ φάσμα ζώων και ανθρώπων.συγκεντρωτικό εστίαμα της GETV σημειώθηκε σε χοιροτροφικές εκμεταλλεύσεις στην επαρχία Χενάν, σηματοδοτώντας ένα από τα πιο διαδεδομένα και συγκεντρωμένα κρούσματα στην ηπειρωτική Κίνα τα τελευταία χρόνια.

Από τον Ιούλιο έως τον Σεπτέμβριο του 2024, ένα συμπυκνωμένο ξέσπασμα του ιού Geta (GETV) σημειώθηκε σε πολλαπλές φάρμες χοίρων στην επαρχία Χεναν.22 εκ των οποίων σχημάτισαν ένα μοναδικό σύμπλεγμα στο φυλογενετικό δέντρο και παρουσίασαν μεταλλάξεις αμινοξέων στις πρωτεΐνες nsP3 και E2.

Τα πειράματα απέδειξαν ότι αυτή η παραλλαγή GIII παρουσίασε σημαντικά αυξημένη παθογονικότητα στα χοιρίδια, με ποσοστό θνησιμότητας 100%, και επίσης παρουσίασε υψηλή παθογονικότητα στα ποντίκια.Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη συστηματική έρευνα για ένα ευρύτατο ξέσπασμα GETV σε αγροκτήματα χοίρων του Χενάν, αποκαλύπτοντας την αυξημένη ιαιτικότητα και τα μοριακά χαρακτηριστικά της παραλλαγής GIII.

Εισαγωγή

Ο ιός Geta (GETV) είναι ένας μονοκύκλος, θετικός ιός RNA που μολύνει ένα ευρύ φάσμα ζώων και μπορεί ακόμη να αποτελέσει απειλή για τους ανθρώπους.σημειώθηκε συμπυκνωμένη εστία της GETV σε εμπορικές εκμεταλλεύσεις χοίρων στην επαρχία ΧενάνΗ παραλλαγή GIII ήταν το κυρίαρχο παθογόνο στέλεχος, παρουσιάζοντας αυξημένη ιογένεια σε σύγκριση με τα προηγούμενα στελέχη.Η παρούσα μελέτη παρέχει ένα σημείο αναφοράς για την κατανόηση της μοριακής επιδημιολογίας και της παθογονικότητας του GETV.

Υλικά και Μέθοδοι

Η μελέτη αυτή χρησιμοποίησε κύτταρα BHK-21 και PK-15 για την καλλιέργεια του απομονωμένου GETV χοίρων HNJZ-S1. Το ιογενές νουκλεϊκό οξύ εξήχθη από ύποπτες μολυσμένες φάρμες χοίρων στο Χεναν και το Σανσί και συνθέθηκε cDNA.Η ανίχνευση του ιού πραγματοποιήθηκε με PCR/RT-PCRΤα θετικά δείγματα απομονώθηκαν, καθαρίστηκαν και εντοπίστηκαν σε κύτταρα.και αλληλουχία για ευθυγράμμιση αλληλουχίας και φυλογενετική ανάλυση.

Σε πειράματα σε ζώα, γουρούνια αρνητικά στο GETV και ποντίκια δύο ημερών ηλικίας που θηλάζουν SPF χορηγήθηκαν ενδομυϊκά ή υποδόρια με τον ιό. Παρατηρήθηκαν κλινικά σημάδια ή θνησιμότητα,και τα ιικά φορτία στο αίμα και τους ιστούς μετρήθηκανΤα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο όρο ± SD και αναλύονται χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 9.0.

Αποτελέσματα έρευνας

1. GETV Συλλογή δειγμάτων και ανίχνευση ιών

Τον Ιούλιο του 2024, σημειώθηκε επιδημία υψηλής θνησιμότητας σε χοιρίδια ηλικίας 3 έως 10 ημερών σε χοιροστάσιο στο Zhumadian της επαρχίας Henan, με ποσοστό νοσηρότητας 30% και ποσοστό θνησιμότητας 80%.Η εργαστηριακή επιβεβαίωση έδειξε ότι η επιδημία προκλήθηκε από ένα μόνο στέλεχος GETVΣτη συνέχεια, υποψίες για επιδημίες GETV εμφανίστηκαν σε χοιροτροφίες στην επαρχία Henan.Η κλινική συλλογή δειγμάτων αποκάλυψε επιδημίες σε 12 από τις 18 πόλεις επιπέδου νομού και σε 21 από τις 157 επαρχίες (Σχήμα 1 ((α))Από τον Ιούλιο έως τον Σεπτέμβριο, υπήρξαν μία, 15 και 16 επιδημίες, αντίστοιχα.Οι αυτοψίες αποκάλυψαν πρησμένη και αιμορραγική λεμφαδενοπάθεια., πνευμονικές αιμορραγίες, διασκορπισμένες επιφανειακές αιμορραγίες και υποδόρια οίδημα (Σχήμα 1 ((β)). Από τα 36 δείγματα θετικά για GETV, μόνο δύο ήταν συν-μολυσμένα με PDCoV, PCV2 ή JEV·τα υπόλοιπα ήταν μολυσμένα με ένα μόνο GETV (Σχήμα 1 (c)).

Σχήμα 1. Σύνοψη της επιδημίας GETV σε αγροκτήματα χοίρων στην επαρχία Χενάν

(α) Κατανομή των εκμεταλλεύσεων χοίρων που παρουσιάζουν GETV στην επαρχία Χενάν. (β) Ακαθάριστες ιστολογικές βλάβες σε μολυσμένα χοιρίδια κατά τη διάρκεια αυτής της επιδημίας.

γ) Η αναγνώριση με PCR του GETV και άλλων ιών σε δείγματα ιστών.

Συμπέρασμα: Η λοίμωξη από τον ιό GETV εμφανίστηκε σε χοιρίδια σε πολλαπλές εκμεταλλεύσεις στην επαρχία Henan, προκαλούμενη κυρίως από έναν μόνο ιό.με μικτές λοιμώξεις που εμφανίζονται σε λίγα δείγματα.

2. Απομόνωση, αναγνώριση και προσδιορισμός τίτλου του GETV

Από 36 θετικά δείγματα, 28 στελέχη GETV απομονώθηκαν με επιτυχία στα κύτταρα BHK-21. Τα HNzk-XH1 και HNzmd-XP1 εντοπίστηκαν ως GETV. Μετά από 48 ώρες μόλυνσης στα κύτταρα BHK-21 ή PK-15, η λοίμωξη με GETV εξαφανίστηκε.σημαντικές κυτταροπαθητικές αλλαγέςΗ RT-PCR και η ηλεκτρονική μικροσκόπηση επιβεβαίωσαν περαιτέρω την ιική ταυτότητα.Οι καμπύλες διάδοσης έδειξαν ότι η κινητική ανάπτυξης των δύο στελεχών του ιού ήταν παρόμοια.Τα αποτελέσματα της εξέτασης πλάκας έδειξαν ότι οι πλάκες των δύο στελεχών του ιού ήταν παρόμοιες σε μέγεθος, αλλά διέφεραν σε αριθμό.

Σχήμα 2. Απομόνωση και χαρακτηρισμός της GETV

(Α) Μετά τη μόλυνση των κυττάρων BHK-21 και PK-15 με HNzk- XH1 ή HNzmd- XP1, παρατηρήθηκαν κυτοπατικές επιδράσεις εντός 12 έως 36 ωρών.

(Β) Τα απομονωμένα GETV εντοπίστηκαν με RT-PCR. (Γ) Η μορφολογία σωματιδίων GETV εξετάστηκε με μικροσκόπηση ηλεκτρονίων.

(δ) Ανάπτυξη του HNzk-XH1 ή του HNzmd-XP1 στα κύτταρα BHK-21 και PK-15. (ε) Μορφολογία πλάκας του GETV στα κύτταρα BHK-21.

Συμπέρασμα: Τα στελέχη GETV HNzk-XH1 και HNzmd-XP1 απομονώθηκαν με επιτυχία από δείγματα χοίρων.με παρόμοια κινητική ανάπτυξης και μεταβολές τίτλου, αλλά με διαφορές στον αριθμό της πλάκας.

3Αλληλουχία και Φυλογενετική Ανάλυση

Οι αλληλουχίες ολόκληρου του γονιδιώματος (αριθμοί προσχώρησης GenBank: PQ658739 ̇ PQ658750) και οι αλληλουχίες γονιδίων E2 (αριθμοί προσχώρησης GenBank: PQ658751 ̇ PQ658766) που προήλθαν από την παρούσα μελέτη υποβλήθηκαν στην GenBank.Η ανάλυση ομολογίας ολόκληρου του γονιδιώματος έδειξε ότι η ταυτότητα των νουκλεοτιδίων μεταξύ των απομονωμένων κυμαινόταν από 98 έως 98.Σε σύγκριση με το στέλεχος αναφοράς, οι νουκλεοτιδικές ταυτότητες αυτών των απομονωμένων με GI, GII, GIV και GIII ήταν 94,8%95,0%, 96Οι ταυτότητες αμινοξέων ήταν 98,5%98,8%, 98,9%99,1%, 98,3%99,5% και 98,7%100,0%, αντίστοιχα.

Η φυλογενετική ανάλυση που βασίστηκε στα γονίδια Ε2 28 απομονωμένων και 12 ολόκληρων γονιδίων αποκάλυψε ότι όλα τα απομονωμένα ανήκαν στην GIII, με απομακρυσμένη συγγένεια με άλλες ομάδες (Σχήμα 3 ((α,β)).Οι περισσότεροι από αυτούς συγκεντρώθηκαν με την παραλλαγή GDHYLC23 (Σχήμα 3(β))Η ευθυγράμμιση της αλληλουχίας αμινοξέων αποκάλυψε τέσσερις μοναδικές μεταλλάξεις στις πρωτεΐνες nsP3 και E2 αυτών των απομονωμένων (Σχήμα 3 ((γ)).οι μεταλλάξεις A381T και V503G βρίσκονται στην περιοχή HVD, και η πρωτεΐνη Ε2 έχει μετάλλαξη D323E στη θέση 323.

Σχήμα 3. Φυλογενετική ανάλυση και ευθυγράμμιση αμινοξέων των απομονωμένων. Φυλογενετική ανάλυση των απομονωμένων με βάση το E2 (α) και το πλήρες γονιδίωμα (β).

Συμπεράσματα: Τα απομονωμένα στην παρούσα μελέτη ανήκουν όλα στον γονότυπο GIII, που σχετίζεται με άλλους γονότυπους και έχουν μοναδικές μεταλλάξεις αμινοξέων στις πρωτεΐνες nsP3 και E2,που επιβεβαιώνει ότι τα απομονωμένα αυτά είναι παραλλαγές GIII.

4Παθογονικότητα του στελέχους GETV HNzk-XH1 σε χοιρίδια

Λόγω του υψηλού ποσοστού θνησιμότητας από εστίες GETV σε εμπορικές εκμεταλλεύσεις χοίρων και των υψηλών τιτρών των ιών GETV που απομονώνονται από κύτταρα BHK-21 και PK-15,το στέλεχος HNzk-XH1 με υψηλότερο τίτλο επιλέχθηκε για την αξιολόγηση της παθογονικότητας στην παρούσα μελέτηΤα χοιρίδια της ομάδας δοκιμής έλαβαν ενδομυϊκή ένεση 107TCID50 του στελέχους HNzk-XH1, ενώ η ομάδα ελέγχου έλαβε ίση ποσότητα μέσου DMEM.24 ώρες μετά την πρόκληση, τα χοιρίδια στην ομάδα πρόκλησης ανέπτυξαν διάρροια, ακολουθούμενη από παράλυση των πίσω άκρων 1,5 ημέρες αργότερα.που επιτυγχάνει ποσοστό θνησιμότητας 100% (Σχήμα 4 (γ))Οι βαθμολογίες κλινικών συμπτωμάτων έδειξαν ότι η ομάδα HNzk-XH1 είχε σημαντικά πιο σοβαρά συμπτώματα από την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4 (b)).ενώ η ομάδα ελέγχου έγινε αυτοψία 8 μέρες αργότερα.Το τοίχωμα του λεπτού εντέρου της ομάδας HNzk-XH1 ήταν σημαντικά αραιωμένο, με κίτρινο υδατικό περιεχόμενο, ενώ το λεπτό έντερο της ομάδας ελέγχου ήταν φυσιολογικό (Σχήμα 4 (α)).Η ανάλυση RT- qPCR αποκάλυψε ότι ο αριθμός αντιγράφων του γονιδίου GETV nsP1 στο αίμα που συλλέχθηκε δύο ημέρες μετά την πρόκληση ήταν κοντά στο 106/ ml.Εξετάσεις του ήπατος, του πνεύμονα, των νεφρών, της σπλήνας, του λεπτού εντέρου,και εγκεφαλικούς ιστούς των χοιροειδών ανιχνεύθηκαν υψηλά ιικά φορτία σε όλα τα όργανα της ομάδας που έχει μολυνθεί με HNzk- XH1, ενώ δεν ανιχνεύθηκε GETV RNA στην ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4 (ε)).

Σχήμα 4. Παθογονικότητα σε χοιρίδια

(α) Κλινικά σημεία και αποτελέσματα αυτοψίας μολυσμένων χοιριδιών. (β) Κλινικά αποτελέσματα μολυσμένων χοιριδιών.

γ) Ποσοστό επιβίωσης των μολυσμένων χοιροειδών. δ) Επίπεδα ιικού RNA στο αίμα των μολυσμένων χοιροειδών την 2η ημέρα μετά τη μόλυνση.

(ε) Τα επίπεδα ιικού RNA σε διάφορα όργανα χοιριδιών που πέθαναν ή υποβλήθηκαν σε ευθανασία μετά τη μόλυνση.

Συμπέρασμα: Το στέλεχος HNzk-XH1 είναι εξαιρετικά παθογόνο για τα χοιρίδια, προκαλώντας γρήγορα σοβαρά κλινικά συμπτώματα και θνησιμότητα.Δεν παρατηρήθηκαν ανωμαλίες στην ομάδα ελέγχου..

5Παθολογικές αλλαγές σε ποντίκια που θηλάζουν και έχουν μολυνθεί με την παραλλαγή HNzk-XH1

Η μελέτη αυτή αποδεικνύει ότι τα ποντίκια που θηλάζουν αποτελούν ιδανικό μοντέλο για τη μελέτη της ιαιτερότητας του GETV.Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι η μόλυνση ποντικών που θηλάζουν με την παραλλαγή HNzk-XH1 προκάλεσε παράλυση των πίσω άκρων και καθυστέρηση της ανάπτυξης (Σχήμα 5 ((α))Αντίθετα, το στέλεχος HNZJ-S1 ήταν λιγότερο θανατηφόρο και τα θηλάζοντα ποντίκια που μολύνθηκαν με χαμηλές δόσεις επέζησαν και κέρδισαν φυσιολογικό βάρος.που δείχνουν ότι υπήρξε σημαντική διαφορά στην παθογονικότητα των δύο στελεχών σε ποντίκια που θηλάζουν.

Σχήμα 5. Σύγκριση της παθογονικότητας του HNzk-XH1 και του HNZJ-S1

(α) Κλινικά συμπτώματα μόλυνσης σε ποντίκια που θηλάζουν. (β) Ποσοστό επιβίωσης σε ποντίκια που θηλάζουν που έχουν μολυνθεί με διαφορετικές δόσεις του στελέχους HNzk-XH1.

(γ) Ποσοστό επιβίωσης ποντικών που θηλάζουν και έχουν μολυνθεί με διαφορετικές δόσεις του στελέχους HNZJ-S1. (δ) Αλλαγές βάρους ποντικών που θηλάζουν και έχουν μολυνθεί με διαφορετικές δόσεις του στελέχους HNzk-XH1.

(ε) Αλλαγές βάρους σε ποντίκια που θηλάζουν και έχουν μολυνθεί με διαφορετικές δόσεις του στελέχους HNZJ-S1.

Συμπέρασμα: Η παραλλαγή HNzk-XH1 είναι πολύ παθογόνος σε ποντίκια που θηλάζουν, προκαλώντας παράλυση των πίσω άκρων, καθυστέρηση ανάπτυξης και γρήγορο θάνατο.και θηλάζοντας ποντίκια που έχουν μολυνθεί με χαμηλές δόσεις επιβιώνουν και διατηρούν φυσιολογικό σωματικό βάρος, γεγονός που δείχνει σημαντική διαφορά στη ιογένεια μεταξύ των δύο στελεχών.

Συμπεράσματα

Η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι η εστία της GETV σε εκμεταλλεύσεις χοίρων στην επαρχία Χενάν από τον Ιούλιο έως τον Σεπτέμβριο του 2024 προσδιορίστηκε ως ανεξάρτητη, διακλαδιστική παραλλαγή της ομάδας GIII,περιέχει τέσσερις μοναδικές μεταλλάξεις αμινοξέων στις πρωτεΐνες E2 και nsP3Σε σύγκριση με προηγούμενα απομονωμένα είδη, αυτή η παραλλαγή παρουσιάζει αυξημένη ιικότητα και μπορεί να έχει μεταδοθεί ήσυχα μέσω χοίρων και κουνουπιών πριν από την επιδημία.Οι κλιματικές συνθήκες και τα πρότυπα κυκλοφορίας των χοίρων επιτάχυναν την εξάπλωση της επιδημίαςΕπί του παρόντος, δεν υπάρχει διαθέσιμο εμβόλιο στην Κίνα, γεγονός που απαιτεί ενισχυμένη παρακολούθηση και έγκαιρες προσαρμογές στις στρατηγικές πρόληψης και ελέγχου.