berita perusahaan tentang Berbagi Penelitian Terbaru. Prevalensi Varian Getavirus GIII dengan Virulensi Meningkat di Peternakan Babi di Provinsi Henan

Virus Geta (GETV) adalah virus yang ditularkan melalui nyamuk yang muncul dan mengancam berbagai hewan dan manusia. Dari Juli hingga September 2024, wabah GETV terkonsentrasi terjadi di peternakan babi di seluruh Provinsi Henan, menandai salah satu wabah paling luas dan terkonsentrasi di daratan Tiongkok dalam beberapa tahun terakhir.

Dari Juli hingga September 2024, wabah virus Geta (GETV) terkonsentrasi terjadi di beberapa peternakan babi di Provinsi Henan. Dua puluh tujuh strain diisolasi dari 31 peternakan babi, 22 di antaranya membentuk kelompok unik dalam pohon filogenetik dan menunjukkan mutasi asam amino pada protein nsP3 dan E2.

Eksperimen menunjukkan bahwa varian GIII ini menunjukkan peningkatan patogenisitas yang signifikan pada anak babi, dengan tingkat kematian 100%, dan juga menunjukkan patogenisitas tinggi pada tikus. Penelitian ini adalah investigasi sistematis pertama dari wabah GETV skala besar di peternakan babi Henan, yang mengungkapkan peningkatan virulensi dan karakteristik molekuler dari varian GIII.

Pendahuluan

Virus Geta (GETV) adalah virus RNA untai tunggal, beruntai positif yang menginfeksi berbagai hewan dan bahkan dapat mengancam manusia. Dari Juli hingga September 2024, wabah GETV terkonsentrasi terjadi di peternakan babi komersial di Provinsi Henan, yang mengakibatkan isolasi 27 strain. Varian GIII adalah strain patogen dominan, yang menunjukkan peningkatan virulensi dibandingkan dengan strain sebelumnya. Penelitian ini memberikan referensi untuk memahami epidemiologi molekuler dan patogenisitas GETV.

Materi dan Metode

Penelitian ini menggunakan sel BHK-21 dan PK-15 untuk mengkultur isolat GETV babi HNJZ-S1. Asam nukleat virus diekstraksi dari peternakan babi yang diduga terinfeksi di Henan dan Shanxi, dan cDNA disintesis. Deteksi virus dilakukan dengan PCR/RT-PCR. Sampel positif diisolasi, dimurnikan, dan diidentifikasi dalam sel. Karakteristik pertumbuhan virus dan pembentukan plak ditentukan. Gen E2 dan seluruh genom diamplifikasi, dikloning, dan diurutkan untuk penyelarasan urutan dan analisis filogenetik.

Dalam percobaan hewan, anak babi negatif GETV dan tikus menyusui SPF berusia dua hari disuntikkan secara intramuskular atau subkutan dengan virus. Tanda-tanda klinis atau kematian diamati, dan muatan virus dalam darah dan jaringan diukur. RNA virus diekstraksi dari sampel jaringan, cDNA disintesis, dan kemudian dideteksi dengan SYBR Green qPCR. Data disajikan sebagai mean ± SD dan dianalisis menggunakan GraphPad Prism 9.0.

Hasil Penelitian

1. Pengumpulan Sampel GETV dan Deteksi Virus

Pada bulan Juli 2024, wabah dengan tingkat kematian tinggi terjadi pada anak babi berusia 3 hingga 10 hari di peternakan babi di Zhumadian, Provinsi Henan, dengan tingkat morbiditas 30% dan tingkat kematian 80%. Konfirmasi laboratorium menunjukkan bahwa wabah tersebut disebabkan oleh satu strain GETV. Selanjutnya, wabah GETV yang diduga terjadi di peternakan babi di seluruh Provinsi Henan. Pengumpulan sampel klinis mengungkapkan wabah di 12 dari 18 kota tingkat prefektur dan 21 dari 157 kabupaten (Gambar 1(a)). Dari Juli hingga September, terdapat satu, 15, dan 16 wabah, masing-masing. Gejala utama pada anak babi adalah diare parah, ataksia, dan kelemahan kaki belakang. Otopsi mengungkapkan pembengkakan dan limfadenopati hemoragik, pendarahan paru-paru, pendarahan superfisial yang tersebar, dan edema subkutan (Gambar 1(b)). Dari 36 sampel positif GETV, hanya dua yang terinfeksi bersama dengan PDCoV, PCV2, atau JEV; sisanya terinfeksi dengan satu GETV (Gambar 1(c)).

Gambar 1. Ikhtisar Wabah GETV di Peternakan Babi di Provinsi Henan

(a) Distribusi peternakan babi positif GETV di Provinsi Henan. (b) Lesi histologis kasar pada anak babi yang terinfeksi selama wabah ini.

(c) Identifikasi PCR GETV dan virus lain dalam sampel jaringan.

Kesimpulan: Infeksi GETV terjadi pada anak babi di beberapa peternakan di Provinsi Henan, terutama disebabkan oleh satu virus. Manifestasi klinis termasuk diare, ataksia, dan kelemahan kaki belakang, dengan infeksi campuran terjadi pada beberapa sampel.

2. Isolasi, Identifikasi, dan Penentuan Titer GETV

Dari 36 sampel positif, 28 strain GETV berhasil diisolasi dalam sel BHK-21. HNzk-XH1 dan HNzmd-XP1 diidentifikasi sebagai GETV. Setelah 48 jam infeksi dalam sel BHK-21 atau PK-15, perubahan sitopatik yang signifikan, termasuk penyusutan sel, pembulatan, dan eksfoliasi, diamati dibandingkan dengan kontrol. RT-PCR dan mikroskop elektron lebih lanjut mengkonfirmasi identitas virus. Kurva proliferasi menunjukkan bahwa kinetika pertumbuhan kedua strain virus serupa, dengan titer mencapai puncak pada 36 jam setelah infeksi dan kemudian menurun. Hasil uji plak menunjukkan bahwa plak dari kedua strain virus serupa dalam ukuran, tetapi berbeda dalam jumlah.

Gambar 2. Isolasi dan Karakterisasi GETV

(A) Setelah infeksi sel BHK-21 dan PK-15 dengan HNzk-XH1 atau HNzmd-XP1, efek sitopatik diamati dalam waktu 12 hingga 36 jam.

(B) Isolat GETV diidentifikasi dengan RT-PCR. (C) Morfologi partikel GETV diperiksa dengan mikroskop elektron.

(d) Pertumbuhan HNzk-XH1 atau HNzmd-XP1 dalam sel BHK-21 dan PK-15. (e) Morfologi plak GETV pada sel BHK-21.

Kesimpulan: Strain GETV HNzk-XH1 dan HNzmd-XP1 berhasil diisolasi dari sampel peternakan babi. Kedua strain menyebabkan efek sitopatik yang signifikan dalam sel, dengan kinetika pertumbuhan dan variasi titer yang serupa, tetapi dengan perbedaan dalam jumlah plak.

3. Pengurutan dan Analisis Filogenetik

Urutan seluruh genom (nomor akses GenBank: PQ658739–PQ658750) dan urutan gen E2 (nomor akses GenBank: PQ658751–PQ658766) yang diperoleh dalam penelitian ini telah diserahkan ke GenBank. Analisis homologi seluruh genom menunjukkan bahwa identitas nukleotida di antara isolat berkisar antara 98,4% hingga 100,0%, dan identitas asam amino berkisar antara 99,3% hingga 100,0%. Dibandingkan dengan strain referensi, identitas nukleotida dari isolat ini dengan GI, GII, GIV, dan GIII adalah 94,8%–95,0%, 96,9%–97,0%, 95,6%–97,3%, dan 96,9%–99,8%, masing-masing. Identitas asam amino adalah 98,5%–98,8%, 98,9%–99,1%, 98,3%–99,5%, dan 98,7%–100,0%, masing-masing.

Analisis filogenetik berdasarkan gen E2 dari 28 isolat dan 12 seluruh genom mengungkapkan bahwa semua isolat termasuk dalam GIII, yang jauh terkait dengan kelompok lain (Gambar 3(a,b)). Sebagian besar dari mereka mengelompok dengan varian GDHYLC23 (Gambar 3(b)). Penyelarasan urutan asam amino mengungkapkan empat mutasi unik pada protein nsP3 dan E2 dari isolat ini (Gambar 3(c)). Mutasi nsP3 P329S terletak di wilayah ZBD, mutasi A381T dan V503G terletak di wilayah HVD, dan protein E2 memiliki mutasi D323E pada posisi 323. Berdasarkan karakteristik ini, isolat dalam klad ini diidentifikasi sebagai varian GIII.

Gambar 3. Analisis filogenetik dan penyelarasan urutan asam amino dari isolat. Analisis filogenetik dari isolat berdasarkan E2 (a) dan genom lengkap (b).

Kesimpulan: Isolat dalam penelitian ini semuanya termasuk dalam genotipe GIII, yang jauh terkait dengan genotipe lain, dan memiliki mutasi asam amino unik pada protein nsP3 dan E2, yang mengkonfirmasi bahwa isolat ini adalah varian GIII.

4. Patogenisitas Strain GETV HNzk-XH1 pada Anak Babi

Karena tingkat kematian yang tinggi dari wabah GETV di peternakan babi komersial dan titer tinggi virus GETV yang diisolasi dari sel BHK-21 dan PK-15, strain HNzk-XH1 dengan titer lebih tinggi dipilih untuk evaluasi patogenisitas dalam penelitian ini. Anak babi dalam kelompok tantangan disuntikkan secara intramuskular dengan 10⁷TCID₅₀ dari strain HNzk-XH1, sedangkan kelompok kontrol disuntikkan dengan volume yang sama dari media DMEM. Dua puluh empat jam setelah tantangan, anak babi dalam kelompok tantangan mengalami diare, diikuti oleh kelumpuhan kaki belakang 1,5 hari kemudian. Dua hari kemudian, beberapa anak babi mati, dan dalam waktu empat hari, semua anak babi telah mati, mencapai tingkat kematian 100% (Gambar 4(c)). Skor gejala klinis menunjukkan bahwa kelompok HNzk-XH1 memiliki gejala yang secara signifikan lebih parah daripada kelompok kontrol (Gambar 4(b)). Anak babi yang mati diotopsi segera, sedangkan kelompok kontrol diotopsi 8 hari kemudian. Dinding usus kecil dari kelompok HNzk-XH1 secara signifikan menipis, dengan isi berwarna kuning dan berair, sedangkan usus kecil dari kelompok kontrol normal (Gambar 4(a)). Analisis RT-qPCR mengungkapkan bahwa jumlah salinan gen nsP1 GETV dalam darah yang dikumpulkan dua hari setelah tantangan mendekati 10⁶/ml, sedangkan tidak ada virus yang terdeteksi dalam kelompok kontrol (Gambar 4(d)). Pemeriksaan jaringan hati, paru-paru, ginjal, limpa, usus kecil, dan otak dari anak babi mengungkapkan muatan virus yang tinggi di semua organ kelompok yang terinfeksi HNzk-XH1, sedangkan tidak ada RNA GETV yang terdeteksi dalam kelompok kontrol (Gambar 4(e)).

Gambar 4. Patogenisitas pada Anak Babi

(a) Tanda-tanda klinis dan hasil otopsi anak babi yang terinfeksi. (b) Skor klinis anak babi yang terinfeksi.

(c) Tingkat kelangsungan hidup anak babi yang terinfeksi. (d) Tingkat RNA virus dalam darah lengkap anak babi pada hari ke-2 pasca-infeksi.

(e) Tingkat RNA virus di berbagai organ anak babi yang mati atau dieutanasia setelah infeksi.

Kesimpulan: Strain HNzk-XH1 sangat patogenik bagi anak babi, dengan cepat menyebabkan gejala klinis yang parah dan kematian. Virus hadir secara luas dalam darah dan organ utama. Tidak ada kelainan yang diamati dalam kelompok kontrol.

5. Perubahan patologis pada tikus menyusui yang terinfeksi dengan varian HNzk-XH1

Penelitian ini menunjukkan bahwa tikus menyusui adalah model yang ideal untuk mempelajari virulensi GETV. Hasil eksperimen menunjukkan bahwa infeksi tikus menyusui dengan varian HNzk-XH1 menyebabkan kelumpuhan kaki belakang dan hambatan pertumbuhan (Gambar 5(a)), dan menyebabkan kematian cepat pada dosis yang berbeda. Sebaliknya, strain HNZJ-S1 kurang mematikan, dan tikus menyusui yang terinfeksi dengan dosis rendah selamat dan mendapatkan berat badan normal, yang menunjukkan bahwa ada perbedaan signifikan dalam patogenisitas kedua strain pada tikus menyusui.

Gambar 5. Perbandingan Patogenisitas HNzk-XH1 dan HNZJ-S1

(a) Gejala klinis infeksi pada tikus menyusui. (b) Tingkat kelangsungan hidup tikus menyusui yang terinfeksi dengan dosis yang berbeda dari strain HNzk-XH1.

(c) Tingkat kelangsungan hidup tikus menyusui yang terinfeksi dengan dosis yang berbeda dari strain HNZJ-S1. (d) Perubahan berat badan tikus menyusui yang terinfeksi dengan dosis yang berbeda dari strain HNzk-XH1.

(e) Perubahan berat badan tikus menyusui yang terinfeksi dengan dosis yang berbeda dari strain HNZJ-S1.

Kesimpulan: Varian HNzk-XH1 sangat patogenik pada tikus menyusui, menyebabkan kelumpuhan kaki belakang, hambatan pertumbuhan, dan kematian cepat. Strain HNZJ-S1 kurang patogenik, dan tikus menyusui yang terinfeksi dengan dosis rendah selamat dan mempertahankan berat badan normal, yang menunjukkan perbedaan signifikan dalam virulensi antara kedua strain.

Kesimpulan

Penelitian ini menunjukkan bahwa wabah GETV di peternakan babi di Provinsi Henan dari Juli hingga September 2024 diidentifikasi sebagai varian cabang independen dari kelompok GIII, yang menyimpan empat mutasi asam amino unik pada protein E2 dan nsP3. Dibandingkan dengan isolat sebelumnya, varian ini menunjukkan peningkatan virulensi dan mungkin telah ditularkan secara diam-diam melalui babi dan nyamuk sebelum wabah. Kondisi iklim dan pola sirkulasi peternakan babi mempercepat penyebaran epidemi. Saat ini, tidak ada vaksin yang tersedia di Tiongkok, yang mengharuskan peningkatan pengawasan dan penyesuaian tepat waktu terhadap strategi pencegahan dan pengendalian.