Het reproductieve en respiratoire syndroom van varkens (PRRS) blijft een van de belangrijkste infectieziekten die de wereldwijde varkensindustrie treffen.De recente verschijning van een hoogpathogene PRRSV-1-stam in het noordoosten van Spanje (voor het eerst gedetecteerd in 2020) heeft nieuwe uitdagingen voor de ziektebestrijding opgeleverd.Hoewel deze virulente stammen in het veld verwoestend zijn, moet hun uitgebreide experimentele karakterisering nog volledig worden onderzocht.Deze studie onderzocht systematisch de genetische oorsprong van de, in vitro replicatie kenmerken en pathogeniteitsmechanismen van de nieuw verschenen, zeer pathogene Spaanse PRRSV-1-stam, Lleida 029_22,via twee infectieroutes (intramusculair en intranasaal).
Een recent onderzoek dat in Wiley Online Library is gepubliceerd, analyseerde de genetische kenmerken en pathogeniteit van de zeer pathogene PRRSV-1-stam Lleida 029_22 bij varkens.Uit de filogenetische analyse is gebleken dat de stam Lleida 029_22 behoort tot een nieuwe clade die geassocieerd is met de uitbraak van PRRSV-1 Rosalia en homoloog is met de zeer pathogene Italiaanse stam PR40Deze stam repliceert in vitro efficiënt in varkens alveolaire macrofagen en PAM-KNU-cellen, maar niet in MARC-145-cellen.
Om de pathogeniteit ervan te beoordelen, werden acht weken oude biggen ingeënt met dezelfde dosis 2×105 TCID5 van Lleida 029_22 via intramusculaire (IM) en intranasale (IN) injecties.IM-inenting resulteerde in 100% sterfte binnen 14 dagen.In tegenstelling hiertoe wordt het gebruik van de geneesmiddelen in het geneesmiddel in de meeste patiënten met een hoge viremie, een hoge uitstorting van virussen, aanzienlijk verhoogde niveaus van pro-inflammatoire cytokines (met name IL-6) en ernstige longlaesies gepaard gegaan.varkens die met het IN-vaccin waren gevaccineerd hadden een lager sterftecijfer (30%) en matige klinische symptomenDe overlevenden herstelden na 63 dagen, maar vertoonden langdurige viremie en uitstorting, en lage niveaus van pro-inflammatoire cytokines en neutraliserende antilichamen vanaf dag 28.
Interessant is dat IN infectie de klinische symptomen van een uitbraak... die veroorzaakt werd door de zeer virulente Rosalia-stam... op Spaanse boerderijen getrouw herhaalde.Infectie via de intraveneuze injectie toonde het risico op nosocomiale overdracht aan..
Achtergrond: Het varkensreproductieve en respiratoire syndroomvirus (PRRSV) is een belangrijke ziekteverwekkende stof die de wereldwijde varkensindustrie bedreigt.De hoge variabiliteit en verscheidenheid van de bestaande vaccins maken dat ze niet altijd effectief zijn.In 2020 verscheen in Spanje een zeer virulente PRRSV-1-stam met de naam "Rosalia" en verspreidde zich snel, wat ernstige verliezen veroorzaakte (bijvoorbeeld verhoogde sterfte tijdens het groeiseizoen).Genetische analyses suggereren dat het waarschijnlijk is ontstaan uit een zeer virulente Italiaanse stamDeze stam veroorzaakt in het veld een hoog abortus- en sterftecijfer (> 20%), maar er ontbreken systematische experimentele gegevens.
Doelstellingen en methoden van het onderzoek: Het doel van dit onderzoek was om de uit de uitbraak van Rosalia geïsoleerde zeer virulente PRRSV-1-stam inhoudelijk te karakteriseren met behulp van in vitro- en in vivo-experimenten.Acht weken oude biggen werden geïnoculeerd via zowel intramusculaire (IM) als intranasale (IN) infectieroutes (IM is de meest gebruikte experimentele route)., terwijl IN een natuurlijke infectie simuleert).
Testdoelstellingen: gedetailleerde documentatie van de klinische symptomen en de mortaliteit; grove, microscopische en immunohistochemische pathologische onderzoeken van overleden/necropseerde varkens; virusbelastingen in serum,speeksel, nasale, rectale en weefsels, evenals virusisolatie, werden uitgevoerd om de virale dynamiek en overdraagbaarheid te begrijpen;en immuunresponsen werden beoordeeld door het analyseren van PRRSV-specifieke en neutraliserende antilichaamspiegels, evenals serum cytokinespiegels.
Belangrijkste betekenis: Dit onderzoek zal een belangrijk experimenteel model en gegevensbasis bieden voor het evalueren van de werkzaamheid van bestaande vaccins, het ontwikkelen van nieuwe vaccins, het opstellen van een nieuwe vaccinatie, het ontwikkelen van nieuwe vaccinaties en het ontwikkelen van nieuwe vaccins.en het verder begrijpen van de pathogenese van deze zeer virulente stam.
Resultaten
1. Filogenetische analyse van PRRSV-1-stammen en Nsp2-aminozuursequentiecharakterisatie
Genomische kenmerken en phylogenetische positionering:
Diepe sequentie (286x) bevestigde dat het PRRSV-1 Lleida 029_22 stamgenome 14,858 nt lang is (figuur 1A), dat filogenetisch behoort tot de PRRSV-1 subtype 1 afstamming.Deze stam vormt een onafhankelijke clade van drie andere stammen die met de uitbraak van Rosalia zijn geassocieerd (figuur 1A), deelt nucleotide-identiteit van 96,61%-97,26% en is homoloog met de hoog pathogene PR40-stam.
Nsp2 verwijderingskenmerken:
Het Nsp2-eiwit van de stam Lleida 029_22 vertoont een 63-aminozuur-delectie (posities 317-379 ten opzichte van de stam Lelystad) (figuur 1B).terwijl de deletie in zijn homologe stam, PR40, is nog groter (figuur 1A), wat suggereert dat deze genetische variatie vroeg in de evolutie van de clade is ontstaan.
Figuur 1. Phylogenetische boom van PRRSV-1 Lleida 029_22 stam en Nsp2-sequentie-uitlijning
(A) Maximale waarschijnlijkheid phylogenetische boom geconstrueerd op basis van de gehele genome sequentie (GTR-model, 1000 bootstrap tests).
▲: Lleida 029_22 stam gebruikt in dit onderzoek; ●: Rosalia-uitbraak-geassocieerde stam.
(B) Gedeeltelijke uitlijning van de aminozuursequentie van Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).
Vergeleken stammen: Lleida 029_22, Rosalia-uitbraak-geassocieerde stam, zeer virulente PR40-stam en prototype Lelystad-stam.
* Opmerking: Nsp2, niet-structuraal eiwit 2; PRRSV-1, varkensreproductieve en respiratoire syndroomvirus type 1.
2In vitro replicatie kenmerken van PRRSV-1 Lleida 029_22 stam
Ten eerste werden de replicatie-eigenschappen van de Lleida 029_22-stam in vitro geëvalueerd. Deze stam repliceerde efficiënt in PAM- en PAM-KNU-cellen, maar niet in MARC-145-cellen (figuur 2A).De virale groeicurven in de drie celtypen vertoonden vergelijkbare virale titers in PAM- en PAM-KNU-cellen.Na 72 uur bereikten beide celtypen virale titers van ongeveer 105TCID50/ml.MARC-145-cellen konden geen efficiënte virale infectie onderhouden, waarbij de virale titers na 72 uur dalen tot onopspoorbare niveaus.
Figuur 2. Groeikinetiek van PRRSV-1 Lleida 029_22 in drie cellijnen
(A) Fluorescentiemicroscopie 72 uur na infectie (MOI = 0.1, kleur met anti-N-eiwit antilichaam; 20x doel)
(B) Dynamica van virale titers in PAM-KNU-cellen (gemiddeld ± SD van drie onafhankelijke experimenten)
*Opmerking: MOI, infectieverscheidenheid; PAM, primaire alveolaire macrophagen; PRRSV-1, varkensreproductief en respiratoir syndroomvirus type 1.
3. Klinische manifestaties en mortaliteit bij met Lleida besmette varkens 029_22
De pathogeniteit van PRRSV-1 Lleida 029_22 werd beoordeeld via intramusculaire (IM) en intranasiale (IN) inentingsroutes.van meer dan 41°C bij 7 dpiDe intranasale inentingsgroep vertoonde een mildere koorts, die slechts kort overschreed 41°C op 5 dagen na de inenting, gevolgd door een intermitterend koortspatroon.De controlegroep vertoonde gedurende het gehele experiment geen abnormale lichaamstemperatuur (figuur 3A)..
Uit klinische observaties bleek dat de IM-geïnfecteerde groep acute ademhalingsstoornissen, neurologische symptomen, ernstige dyspnea en cyanose van de oren en het scrotum ervoerde.De IN-geïnfecteerde groep had voornamelijk matigeBijkomende klinische symptomen waren versleten vacht, oedeem (meest uitgesproken op de ledematen en nek), gewrichtsontsteking en algemene verslechtering van de conditie van het lichaam in beide groepen.maar deze waren ernstiger in de IM-groepDeze ernstige klinische manifestaties waren vooral geconcentreerd tussen 12 en 14 dagen na de inenting, wat samenviel met de periode van hoge sterfte of euthanasie om sociale redenen.
Over het algemeen waren de klinische scores in de IM-geïnfecteerde groep significant hoger dan in de IN-geïnfecteerde groep op 11, 12 en 14 dagen na de inenting (p < 0,05),maximaal 14 dagen na de inenting (figuur 3B)De klinische scores in de IN-groep waren lager en bereikten hun hoogtepunt 13 dagen na infectie (dpi).De resultaten waren echter aanzienlijk hoger dan in de controlegroep (p < 0)..05) Tijdens het hele experiment werden in de controlegroep geen klinische symptomen waargenomen (figuur 3B).
Linear mixed model analysis (accounting for the non-independence of observations from the same animal at different time points) revealed that group- and day-specific variables significantly influenced body temperature and clinical scores during the first 14 days (p < 0.05) Er werden significante verschillen vastgesteld tussen de IM- en IN-groepen, evenals tussen beide infectiegroepen en de controlegroep.
De overlevingsanalyse toonde aan dat alle dieren in de IM-infectiegroep vóór 14 dagen na de infectie stierven, met een sterftecijfer van 100%.Natuurlijke of veroorzaakte sterfgevallen waren geconcentreerd tussen 12 en 14 dagen na infectie.In de IN-infectiegroep was de mortaliteit 30% op 63 dagen na infectie, met sterfgevallen op 12, 21 en 43 dagen na infectie.Alle dieren in de controlegroep overleefden tot het einde van het experiment (figuur 3C).
Figuur 3. Klinische uitkomsten bij varkens geïnfecteerd met PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) Dagelijkse rectale temperaturen na infectie (Rode gestreepte lijn: koortsdrempel > 41°C; gemiddelde ± SD)
(B) Dagelijkse gemiddelde klinische score (gemiddelde ± SD; identieke letters geven geen significante verschillen tussen de groepen aan, p < 0,05)
(C) Overlevingscurves voor proefgroepen
Opmerking: C, controlegroep; IM, intramusculaire groep; IN, intranasale groep.
4Viremie en virale afvoer bij met PRRSV besmette dieren
De viraemiewaarden na PRRSV-1 Lleida 029_22-infectie werden beoordeeld met RT-qPCR.met significante verschillen tussen de IM- en IN-groepen in vergelijking met de controlegroep, die negatief bleef (p < 0.05De viremie in de IN-groep bereikte een hoogtepunt 7 dagen na de infectie.terwijl de virale lading in de IM-groep significant hoger was dan die in de IN- en controlegroepen op zowel 7 als 14 dagen na infectie (p < 0).Daarna daalde de virale lading in de IN-groep geleidelijk, maar was nog steeds aanzienlijk hoger dan in de controlegroep met 28 dpi.
Figuur 4. De uitstorting van het virus werd beoordeeld met speeksel- en neus-/rectale tampons. Alle besmette dieren testten positief op het virus bij 3 dpi in speeksel-, neus- en rectale tampons.
De speekselvloeistof bleef tot 14 dpi in de IM-groep en tot het einde van het experiment in de IN-groep (piek bij 3 dpi; figuur 4B).
Naasvloeistof bereikte een piek van 7 dpi in beide groepen, met significant hogere virale ladingen in de IM-groep bij 7/14 dpi dan in de IN-groep (*p<0.05figuur 4C).
De rectale uitstorting bleef tot 14 dpi in de IM-groep en tot 35 dpi in de IN-groep (met een lichte terugslag op 56 dpi), met beide pieken op 7 dpi (figuur 4D).
De AUC-analyse bevestigde dat de virale lading in alle monsters van de geïnfecteerde groepen significant hoger was dan die in de controlegroep,en dat het aantal neussproeiers in de IM-groep hoger was dan in de IN-groep (*p<0)..05). Kortom, PRRSV-afvoer vindt vroeg plaats en wordt na besmetting voortgezet.
5. Verificatie van isolatie van infectieuze PRRSV uit RT-qPCR-positieve monsters
Om de aanwezigheid van besmettelijk virus in RT-qPCR-positieve monsters te bevestigen, werden virusisolatie (VI) -experimenten uitgevoerd met behulp van PAM-KNU-cellen (figuur 5). the success rate of virus isolation was 100% (10/10) for samples collected between 3 and 14 days post-inoculation (dpi) in the IM group and 100% (10/10) for samples collected between 3 and 7 days post-inoculation (dpi) in the IN groupHet succespercentage daalde echter geleidelijk op 14 dagen na vaccinatie (70%), 21 dagen na vaccinatie (55,6%) en 28 dagen na vaccinatie (12,5%).
Figuur 5. Drie infectieuze virusstammen werden met succes geïsoleerd uit speekselmonsters die werden verzameld van beide geïnfecteerde dieren op 3 dagen na de infectie (dpi) na twee cultuurpassages.Geen besmettelijk virus werd geïsoleerd uit neus- of rectale tampons.
6. Cytokine reacties veroorzaakt door PRRSV-1 Lleida 029_22 Infectie
Serummonsters werden verzameld tijdens de eerste 14 dagen na de infectie om de cytokinespiegels te beoordelen, waardoor significante verschillen tussen de drie groepen werden aangetoond (figuur 6).De IFN-α- niveaus waren significant verhoogd in beide infectiegroepen na 3, 7 en 14 dagen na infectie (dpi), met IFN-α-spiegels in de IM-groep significant hoger dan in de IN-groep op 14 dagen na infectie (p<0,05).en IL-6 vertoonden vergelijkbare trends: IL- 1α steeg in de IN-groep 3 dagen na infectie en bleef stabiel,De IL-6-spiegels in de IM-groep waren significant hoger dan in de controlegroep op 7 en 14 dagen na de infectie (figuur 6B).Het is bijzonder opmerkelijk dat de IL-6-spiegels op 14 dagen na de infectie (p<0,05) significant hoger waren in de IM-groep dan in de IN-groep.IL-1β in beide groepen besmette dieren vertoonde een toenemende trend., waarbij de IM-groep aanzienlijk hogere niveaus vertoonde dan de controlegroep bij 3, 7 en 14 dpi, terwijl de IN-groep slechts een significant verschil vertoonde bij 14 dpi (figuur 6C).
Figuur 6. IL-12-spiegels waren significant hoger in de IM-groep dan in de IN-groep en de controlegroep bij 14 dpi (figuur 6F).De algemene trend toonde een sterkere pro-inflammatoire cytokine respons in de IM-groep.Het was positief gecorreleerd met het 100% sterftecijfer in de IM-groep.
7. Specifieke en neutraliserende antistofreacties bij met PRRSV-1 geïnfecteerde dieren Lleida 029_22
PRRSV-1- en PRRSV-2-specifieke antilichamen werden beoordeeld met behulp van commerciële ELISA-kits (figuur 7A).Serokonversie vond plaats bij 70% van de dieren in de IM-groep en bij 90% van de dieren in de IN-groep bij 14 dpi.De antilichaamspiegels in de IN-groep begonnen te dalen bij 21 dpi, bleven stabiel bij 42 dpi,Rebounded bij 56 dpiDe controlegroep bleef gedurende het hele experiment seronegatief (S/P < 0,4).
Figuur 7. Neutraliserende antilichaamtesten toonden aan dat in de IN-groep slechts een lage titer van 2 log2 werd gedetecteerd bij 28 dpi, die vervolgens geleidelijk toenam tot 3,71 log2 bij 56 dpi (figuur 7B).Titeringen van antilichamen varieerden tussen individuen op hetzelfde tijdstipIn de controlegroep werden geen neutraliserende antilichamen gedetecteerd..
8. Detectie en isolatie van PRRSV-1 Lleida 029_22 in weefselhomogenaten
RT-qPCR werd gebruikt om de virale lading in verschillende weefsels te meten (figuur 4F).mediastinale lymfeklierenIn de IN-groep varieerden de virale belastingen aanzienlijk tussen de weefsels, met de hoogste belastingen in de amandelen en de mediastinale lymfeklieren.De totale virale lading in de IN-groep was lager dan in de IM-groep., wat mogelijk gerelateerd is aan de verschillende tijd van de autopsie.De significante variabiliteit in de weefselbelasting bij geïnfecteerde dieren in de IN-groep was ook geassocieerd met verschillende tijdstippen van overlijden (grijzende monsters op 12 uur na de inenting).In geen enkel weefselmonster uit de controlegroep werd viraal RNA gedetecteerd.
Tabel 1. Weefsels verzameld van dieren die 12, 21 of 43 dagen na de infectie gestorven zijn en positief getest zijn op aVI.
(Tabelnoot: Tabel 1 geeft een samenvatting van de resultaten van RT-qPCR en virusisolatie uit weefselmonsters. "MLN" duidt op mediastinale lymfeklieren en "ILN" op inguinale lymfeklieren.)
9Patologische en immunohistochemische analyse van PRRSV-geïnfecteerde weefsels
Necropsiebevindingen: dieren die stierven na PRRSV-infectie (vooral die die stierven tussen 12 en 21 dagen na infectie) vertoonden significante systemische laesies, waaronder paarse huid,algemene oedeemLymfadenopathie, ernstige lymfadenopathie, splenomegalie (soms met folliculaire hyperplasie) en maagbloeding.en roodbruine kleuren.Bij ongeveer 20% van de dieren met een intranasale infectie ontwikkelden ook abcessen.pericarditisEr werden geen grove laesies waargenomen bij de controledieren.
Figuur 8. De histopathologische analyse toonde aan dat de interstitiële longontstekingscores bij dieren die vroeg stierven (12-21 dpi) in de IM- en IN-groepen varieerden van 1,83 tot 3,33 punten.Deze cijfers werden significant verlaagd bij dieren geslacht bij 63 dpi (controle groep)Vooral opmerkelijk was dat de histologische score van de amandelen in de IN-groep significant hoger was dan die in de controlegroep met 63 dpi (p<0,05),maar geen significante verschillen werden waargenomen in andere weefsels (figuur 8C).
(Titel: figuur 8B toont de histopathologische scores en figuur 8C vergelijkt de histologische scores van de verschillende groepen met 63 dpi)
Microscopische pathologie onthulde interstitiële longontsteking (verdikking van de alveolaire wand, celproliferatie en ontstekingscelinfiltratie) in de longen van alle geïnfecteerde dieren.Er waren exsudaat en nekrotisch weefsel aanwezig in de alveoli.Lymfoïde weefsel (lymfeklieren en milt) vertoonde ernstige lymfopenie en necrose, vergezeld van vasculaire schade (bijv. trombose en vasculitis).Infiltratie van perivasculaire ontstekingscellen, oedeem en gliose werden waargenomen in de hersenwitte stof (figuur 9A).
Immunohistochemische (IHC) analyses detecteerden PRRSV-antigenen in macrophagen, en af en toe in pneumocyten type II, uit de longen, lymfeklieren, amandelen en milt van geïnfecteerde dieren (figuur 9B).Er werden ook virale antigenen aangetroffen in perivasculaire ontstekingscellen in de hersenen..
Figuur 9. PRRSV-infectie veroorzaakt uitgebreide pathologische schade aan de longen, lymfoïde weefsels en hersenen, voornamelijk gelokaliseerd in macrofagen, met systemische pathologische kenmerken.
Bespreking
PRRSV heeft een beperkt tropisme voor monocytaire cellijnen en is traditioneel geïsoleerd en gekweekt met behulp van alveolaire macrophagen (PAM's) en MARC-145-cellen.PAM's zijn moeilijk te verkrijgen en hebben een grote variatie van batch tot batchIn deze studie hebben we de onsterfelijke cellijn PAM-KNU gebruikt, die gevoelig is voor bepaalde veldstammen, in plaats van PAM's.We hebben de Lleida 029_22-stam met succes geïsoleerd., waarvan de groeicurve vergelijkbaar was met die waargenomen bij PAM's.en toekomstige inspanningen zijn nodig om geschiktere cellijnen te identificeren voor het isoleren van verschillende stammen.
Conclusies
Deze studie heeft met succes een model vastgesteld van een intranasale infectie met een zeer virulente PRRSV-1-stam.en viremie) sterk lijken op die waargenomen bij velduitbraken.De belangrijkste bevinding was dat de infectieroute de uitkomst aanzienlijk beïnvloedde: intramusculaire infectie (IM) resulteerde in 100% acute mortaliteit.In het geval van een intranasal (IN) infectie was het sterftecijfer slechts 30%, en de geïnfecteerde varkens zijn uiteindelijk volledig hersteld.Dit significante verschil benadrukt het risico dat IM-injectiepraktijken op bedrijven de ernst van de epidemie door nosocomiale overdracht aanzienlijk kunnen verergeren..
Uw bericht moet tussen de 20-3.000 tekens bevatten!