εταιρικά νέα για Ο ιός του συνδρόμου αναπαραγωγής και αναπνευστικού συστήματος των χοίρων τύπου 1 είναι εξαιρετικά λοιμογόνος στα γουρούνια.

Το αναπαραγωγικό και αναπνευστικό σύνδρομο των χοίρων (PRRS) παραμένει μια από τις σημαντικότερες μολυσματικές ασθένειες που επηρεάζουν την παγκόσμια βιομηχανία χοίρων. Η πρόσφατη εμφάνιση ενός εξαιρετικά παθογόνου στελέχους PRRSV-1 στη βορειοανατολική Ισπανία (που ανιχνεύθηκε για πρώτη φορά το 2020) παρουσίασε νέες προκλήσεις για τον έλεγχο των ασθενειών. Αν και αυτά τα μολυσματικά στελέχη είναι καταστροφικά στον τομέα, ο ολοκληρωμένος πειραματικός χαρακτηρισμός τους δεν έχει ακόμη διερευνηθεί πλήρως. Ως εκ τούτου, η μελέτη αυτή διερεύνησε συστηματικά τη γενετική προέλευση, τα in vitro χαρακτηριστικά αντιγραφής και τους μηχανισμούς παθογένειας του νεοσυσταθέν, υψηλής παθογόνου ισπανικού στελέχους PRRSV-1, LLEIDA 029_22, μέσω διπλών δρομολογίων μόλυνσης (ενδομυϊκή και ενδορινική).

Μια πρόσφατη μελέτη που δημοσιεύθηκε στην Wiley Online βιβλιοθήκη ανέλυσε τα γενετικά χαρακτηριστικά και την παθογένεια του εξαιρετικά παθογόνου στελέχους PRRSV-1 Lleida 029_22 σε χοίρους. Η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψε ότι το στέλεχος Lleida 029_22 ανήκει σε ένα νέο clade που σχετίζεται με την επιδημία PRRSV-1 Rosalia και είναι ομόλογη με το εξαιρετικά παθογόνο ιταλικό στέλεχος PR40. Αυτό το στέλεχος επαναλαμβάνεται αποτελεσματικά σε κυψελιδικά μακροφάγα χοίρων και κύτταρα PAM-Knu in vitro, αλλά όχι σε κύτταρα Marc-145.

Για να εκτιμηθεί η παθογένεια της, τα χοιρίδια ηλικίας οκτώ εβδομάδων ενοφθαλμίστηκαν με την ίδια δόση 2 χ 10 ⁵ TCID⁵ Lleida 029_22 μέσω ενδοκυτταρικών (IM) και ενδορινικών (IN) ενέσεων. Ο ενοφθαλμισμός IM είχε ως αποτέλεσμα 100% θνησιμότητα εντός 14 ημερών, συνοδευόμενη από υψηλή ιρεμία, υψηλή απόρριψη ιικών, σημαντικά αυξημένα επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών (ιδιαίτερα IL-6) και σοβαρές πνευμονικές βλάβες. Αντίθετα, οι χοίροι που εμβολιάστηκαν με το εμβόλιο στο εμβόλιο είχαν χαμηλότερο ποσοστό θνησιμότητας (30%) και μέτρια κλινικά σημεία. Οι επιζώντες ανακτήθηκαν μετά από 63 ημέρες, αλλά εμφάνισαν παρατεταμένη ιρεμία και αποβολή και χαμηλά επίπεδα προφλεγμονωδών κυτοκινών και εξουδετερωτικών αντισωμάτων από την 28η ημέρα και μετά.

Είναι ενδιαφέρον το γεγονός ότι σε μόλυνση ανακεφαλαιοποίησε πιστά τα κλινικά συμπτώματα μιας επιδημίας που προκλήθηκε από το εξαιρετικά μολυσματικό στέλεχος Rosalia στις ισπανικές εκμεταλλεύσεις, ενώ η μόλυνση IM υπογράμμισε τον κίνδυνο νοσηλευτικής μετάδοσης.

Ιστορικό: Ο ιός αναπαραγωγικού και αναπνευστικού συνδρόμου χοίρου (PRRSV) είναι ένα σημαντικό παθογόνο που απειλεί την παγκόσμια βιομηχανία χοίρων. Η μεγάλη μεταβλητότητα και η ποικιλομορφία του καθιστούν τα υπάρχοντα εμβόλια ασυμβίβαστα αποτελεσματικά. Το 2020, ένα εξαιρετικά μολυσματικό στέλεχος PRRSV-1 που ονομάζεται "Rosalia" εμφανίστηκε στην Ισπανία και εξαπλώθηκε γρήγορα, προκαλώντας σοβαρές απώλειες (π.χ. αυξημένη θνησιμότητα κατά τη διάρκεια της καλλιεργητικής περιόδου). Η γενετική ανάλυση υποδηλώνει ότι πιθανότατα προέκυψε από ένα εξαιρετικά μολυσματικό ιταλικό στέλεχος, PR40, μέσω ανασυνδυασμού. Αυτό το στέλεχος προκαλεί υψηλά ποσοστά αμβλώσεων και θνησιμότητας (> 20%) στον τομέα, αλλά λείπουν συστηματικά πειραματικά δεδομένα.

Στόχοι και μεθόδους μελέτης: Η μελέτη αυτή αποσκοπούσε στον συνολικά χαρακτηρισμό του εξαιρετικά μολυσματικού στελέχους PRRSV-1 που απομονώθηκε από την επιδημία Rosalia χρησιμοποιώντας in vitro και in vivo πειράματα. Τα χοιρίδια ηλικίας οκτώ εβδομάδων ενοφθαλμίστηκαν τόσο μέσω ενδομυϊκών (IM) όσο και ενδορινικών (σε) διαδρομών λοίμωξης (το IM είναι η συνήθως χρησιμοποιούμενη πειραματική διαδρομή, ενώ σε προσομοιώνει τη φυσική λοίμωξη).

Στόχοι δοκιμών: Λεπτομερής τεκμηρίωση κλινικών συμπτωμάτων και θνησιμότητας. ακαθάριστες, μικροσκοπικές και ανοσοϊστοχημικές παθολογικές εξετάσεις των νεκρών/νεκροψημένων χοίρων. Τα ιικά φορτία στον ορό, το σάλιο, τα ρινικά επιχρίσματα, τα επιχρίσματα του ορθού και τους ιστούς, καθώς και την απομόνωση του ιού, πραγματοποιήθηκαν για να κατανοηθούν η ιική δυναμική και η μεταδοτική. και οι ανοσοαποκρίσεις αξιολογήθηκαν με την ανάλυση των επιπέδων αντισωμάτων ειδικά για PRRSV και εξουδετέρωσης, καθώς και τα επίπεδα κυτοκίνης στον ορό.

Βασική σημασία: Αυτή η μελέτη θα παράσχει ένα βασικό πειραματικό μοντέλο και βάση δεδομένων για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των υφιστάμενων εμβολίων, την ανάπτυξη νέων εμβολίων και την περαιτέρω κατανόηση της παθογένεσης αυτού του εξαιρετικά μολυσματικής πίεσης.

Αποτελέσματα

1. Φυλογενετική ανάλυση των στελεχών PRRSV-1 και του χαρακτηρισμού αλληλουχίας αμινοξέων NSP2

Γονιδιωματικά χαρακτηριστικά και φυλογενετική τοποθέτηση:

Η βαθιά αλληλουχία (286 ×) επιβεβαίωσε ότι το γονιδίωμα του στελέχους PRRSV-1 LLEIDA 029_22 έχει μήκος 14,858 nt (Σχήμα 1Α), που ανήκει στη γενεά του υποτύπου PRRSV-1. Αυτό το στέλεχος σχηματίζει ένα ανεξάρτητο clade από τρία άλλα στελέχη που σχετίζονται με την επιδημία Rosalia (Σχήμα 1Α), που μοιράζονται ταυτότητα νουκλεοτιδίων 96,61%-97,26%και είναι ομόλογη με το εξαιρετικά παθογόνο στέλεχος PR40.

Χαρακτηρισμός διαγραφής NSP2:

Η πρωτεΐνη NSP2 του στελέχους LLEIDA 029_22 παρουσιάζει διαγραφή 63 αμινοξέων (θέσεις 317-379 σε σχέση με το στέλεχος Lelystad) (Σχήμα 1Β). Αυτή η διαγραφή διατηρείται μέσα στο Rosalia clade, ενώ η διαγραφή στο ομόλογο στέλεχος, PR40, είναι ακόμα μεγαλύτερη (Σχήμα 1Α), υποδηλώνοντας ότι αυτή η γενετική παραλλαγή προέκυψε νωρίς στην εξέλιξη του clade.

Εικόνα 1. Φυλογενετικό δέντρο του PRRSV-1 LLEIDA 029_22 Στέλεχος και ευθυγράμμιση αλληλουχίας NSP2
(Α) Φυσυογενετικό δέντρο μέγιστης πιθανότητας που κατασκευάστηκε με βάση ολόκληρη την αλληλουχία γονιδιώματος (μοντέλο GTR, 1000 δοκιμές bootstrap).

▲: LLEIDA 029_22 Στέλεχος που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. ●: Το στέλεχος που σχετίζεται με την επιδημία της Rosalia.
(Β) Ευθυγράμμιση μερικής αλληλουχίας αμινοξέων NSP2 (Clustal Genomics Workbench 24.0.1).

Συγκριτικά στελέχη: LLEIDA 029_22, Σχετικό με το Rosalia Rosalia, το έντονο στέλεχος PR40 και το πρωτότυπο στέλεχος Lelystad.
*Σημείωση: NSP2, μη δομική πρωτεΐνη 2; PRRSV-1, ιού αναπαραγωγικού και αναπνευστικού συνδρόμου χοίρου τύπου 1.

2.

Πρώτον, τα χαρακτηριστικά αναπαραγωγής του στελέχους LLEIDA 029_22 αξιολογήθηκαν in vitro. Αυτό το στέλεχος επαναλαμβάνεται αποτελεσματικά σε κύτταρα PAMS και PAM-KNU, αλλά όχι σε κύτταρα Marc-145 (Σχήμα 2Α). Οι καμπύλες ανάπτυξης του ιού στους τρεις τύπους κυττάρων έδειξαν παρόμοιους ιικούς τίτλους σε κύτταρα PAMS και PAM-KNU, αν και τα τελευταία είχαν ελαφρώς χαμηλότερους τίτλους (Σχήμα 2Β). Στις 72 ώρες, και οι δύο τύποι κυττάρων έφθασαν σε ιούς τίτλους περίπου 10⁵tcid₅₀/ml. Αντίθετα, τα κύτταρα Marc-145 δεν μπόρεσαν να διατηρήσουν την αποτελεσματική ιογενή λοίμωξη, με τους ιούς τίτλους να πέφτουν σε μη ανιχνεύσιμα επίπεδα μετά από 72 ώρες.

Εικόνα 2. Κινητική ανάπτυξη του PRRSV-1 LLEIDA 029_22 σε τρεις κυτταρικές σειρές
(Α) Μικροσκοπία φθορισμού 72 ώρες μετά τη μόλυνση (ΜΟΙ = 0,1, χρώση με αντι-Ν πρωτεϊνικό αντίσωμα, 20x αντικειμενικός)
(Β) Δυναμική των ιογενών τίτλων σε κύτταρα Pam-Knu (μέση ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων)
*Σημείωση: moi, πολλαπλότητα μόλυνσης. Pam, πρωτογενή κυψελιδικά μακροφάγα. PRRSV-1, ιού αναπαραγωγικού και αναπνευστικού συνδρόμου χοίρου τύπου 1.

3. Κλινικές εκδηλώσεις και θνησιμότητα σε χοίρους που έχουν μολυνθεί με Lleida 029_22

Η παθογένεια του PRRSV-1 LLEIDA 029_22 αξιολογήθηκε με ενδομυϊκές (IM) και ενδορινικές (IN) διαδρομές εμβολιασμού. Οι χοίροι στην ομάδα IM έδειξαν αύξηση της θερμοκρασίας του σώματος ξεκινώντας από 1 dpi, άνω των 41 ° C στα 7 dpi και επιμένουν μέχρι τα 13 dpi. Η ενδορινική ομάδα εμβολιασμού παρουσίασε έναν ήπιο πυρετό, που υπερβαίνει εν συντομία τους 41 ° C στις 5 ημέρες μετά τη μετατόπιση, ακολουθούμενη από ένα διαλείπουσα μοτίβο πυρετού. Η ομάδα ελέγχου δεν παρουσίασε μη φυσιολογικές θερμοκρασίες σώματος σε όλο το πείραμα (Εικόνα 3Α).

Οι κλινικές παρατηρήσεις αποκάλυψαν ότι η ομάδα που έχει μολυνθεί από το IM παρουσίασε οξεία αναπνευστική δυσφορία, νευρολογικά συμπτώματα, σοβαρή δύσπνοια και κυάνωση των αυτιών και του όσχεου, ενώ η ενισχυμένη ομάδα παρουσίασε κυρίως με μέτρια, επίμονη δύσπνοια. Πρόσθετα κλινικά συμπτώματα περιελάμβαναν κουρελιασμένη γούνα, οίδημα (το πιο έντονο στα άκρα και το λαιμό), τη φλεγμονή των αρθρώσεων και τη συνολική επιδείνωση της κατάστασης του σώματος και στις δύο ομάδες, αλλά αυτές ήταν πιο σοβαρές στην ομάδα IM. Αυτές οι σοβαρές κλινικές εκδηλώσεις συγκεντρώθηκαν κατά κύριο λόγο μεταξύ 12 και 14 ημερών μετά τη μετατόπιση, που συμπίπτουν με την περίοδο υψηλής θνησιμότητας ή ευθανασίας για λόγους ευημερίας.

Συνολικά, οι κλινικές βαθμολογίες στην ομάδα μολυσμένων με IM ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες της ομάδας που έχουν μολυνθεί στις 11, 12 και 14 ημέρες μετά τον τομέα (p <0,05), που κορυφώνονται στις 14 ημέρες μετά τη μετατόπιση (Σχήμα 3Β). Οι κλινικές βαθμολογίες στην ομάδα ήταν χαμηλότερες, φτάνοντας στην κορυφή τους σε 13 ημέρες μετά τη μόλυνση (DPI). Τα συμπτώματα σταδιακά υποχώρησαν στη συνέχεια, αλλά οι βαθμολογίες παρέμειναν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες της ομάδας ελέγχου (P <0,05). Δεν παρατηρήθηκαν κλινικά συμπτώματα στην ομάδα ελέγχου σε όλο το πείραμα (Εικόνα 3Β).

Η γραμμική ανάμικτη ανάλυση μοντέλου (που αντιπροσωπεύει τη μη ανεξαρτησία των παρατηρήσεων από το ίδιο ζώο σε διαφορετικά χρονικά σημεία) αποκάλυψε ότι οι μεταβλητές που αφορούν την ομάδα και την ημέρα επηρέασαν σημαντικά τη θερμοκρασία του σώματος και τις κλινικές βαθμολογίες κατά τις πρώτες 14 ημέρες (P <0,05). Σημαντικές διαφορές εντοπίστηκαν μεταξύ του IM και των ομάδων, καθώς και μεταξύ των ομάδων μόλυνσης και της ομάδας ελέγχου.

Η ανάλυση επιβίωσης έδειξε ότι όλα τα ζώα στην ομάδα λοίμωξης IM πέθαναν πριν από 14 ημέρες μετά τη μόλυνση, με ποσοστό θνησιμότητας 100%. Οι φυσικοί ή επαγόμενοι θάνατοι συγκεντρώθηκαν μεταξύ 12 και 14 ημερών μετά τη μόλυνση. Στην ομάδα μόλυνσης, η θνησιμότητα ήταν 30% κατά 63 ημέρες μετά τη μόλυνση, με τους θανάτους να εμφανίζονται στις 12, 21 και 43 ημέρες μετά τη μόλυνση. Όλα τα ζώα στην ομάδα ελέγχου επιβίωσαν μέχρι το τέλος του πειράματος (Εικόνα 3C).

Εικόνα 3. Κλινικά αποτελέσματα σε χοίρους μολυσμένα με PRRSV-1 LLEIDA 029_22
(Α) ημερήσιες θερμοκρασίες του ορθού μετά τη μόλυνση (κόκκινη διακεκομμένη γραμμή: κατώφλι πυρετού> 41 ° C, μέσος όρος ± SD)
(Β) Ημερήσια μέση κλινική βαθμολογία (μέσος όρος ± SD, ταυτόσημα γράμματα δεν υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές μεταξύ ομάδων, p <0,05)
(Γ) Καμπύλες επιβίωσης για πειραματικές ομάδες
Σημείωση: C, ομάδα ελέγχου. IM, ενδομυϊκή ομάδα. Σε, ενδορινική ομάδα.

4. Βιρεμία και ιική απόρριψη σε ζώα μολυσμένα με PRRSV

Τα επίπεδα viraemia μετά από PRRSV-1 LLEIDA 029_22 μόλυνση αξιολογήθηκαν με RT-qPCR. Το PrRSV RNA ανιχνεύθηκε στον ορό όλων των μολυσμένων ζώων σε 3 ημέρες μετά τη μόλυνση, με σημαντικές διαφορές μεταξύ του ΙΜ και σε ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η οποία παρέμεινε αρνητική (Ρ <0,05, Σχήμα 4Α). Η Viraemia στην ομάδα στο IN κορυφώθηκε στις 7 ημέρες μετά τη μόλυνση, ενώ τα ιικά φορτία στην ομάδα IM ήταν σημαντικά υψηλότερα από εκείνα των ομάδων IN και ελέγχου και στις 7 και 14 ημέρες μετά τη μόλυνση (P <0,05). Στη συνέχεια, το ιικό φορτίο στην ομάδα μειώθηκε σταδιακά, αλλά εξακολουθούσε να είναι σημαντικά υψηλότερη από αυτή της ομάδας ελέγχου στα 28 dpi.

Εικόνα 4. Η απόρριψη ιογενών αξιολογήθηκε με σάλιο και ρινικά/ορθικά επιχρίσματα. Όλα τα μολυσμένα ζώα δοκιμάστηκαν θετικά για τον ιό σε 3 dpi σε σάλιο, ρινικά και ορθικά επιχρίσματα.

Η απόρριψη των σιελογόνων συνεχίστηκε μέχρι τα 14 dpi στην ομάδα IM και μέχρι το τέλος του πειράματος στην ομάδα (κορυφή στα 3 dpi, Σχήμα 4Β).

Η ρινική απόρριψη κορυφώθηκε στα 7 dpi και στις δύο ομάδες, με σημαντικά υψηλότερα φορτία ιογενών στην ομάδα IM σε 7/14 dpi από ό, τι στην ομάδα (*p <0,05, Εικόνα 4C).

Η απόρριψη του ορθού συνεχίστηκε μέχρι τα 14 dpi στην ομάδα IM και μέχρι τα 35 dpi στην ομάδα (με ελαφρά ανάκαμψη στα 56 dpi), με τις δύο κορυφές στα 7 dpi (Σχήμα 4D).

Η ανάλυση AUC επιβεβαίωσε ότι τα ιικά φορτία σε όλα τα δείγματα από τις μολυσμένες ομάδες ήταν σημαντικά υψηλότερα από αυτά της ομάδας ελέγχου και ότι τα ρινικά φορτία επιχρίσεων στην ομάδα IM ήταν υψηλότερα από αυτά της ομάδας (*p <0,05). Συνοπτικά, η απόρριψη PRRSV εμφανίζεται νωρίς και διατηρείται μετά τη μόλυνση.

5. Επαλήθευση της απομόνωσης του μολυσματικού PRRSV από δείγματα θετικών RT-qPCR

Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία μολυσματικού ιού σε δείγματα θετικών RT-qPCR, πραγματοποιήθηκαν πειράματα απομόνωσης ιού (VI) χρησιμοποιώντας κύτταρα PAM-Knu (Σχήμα 5). Για δείγματα ορού, το ποσοστό επιτυχίας της απομόνωσης του ιού ήταν 100% (10/10) για δείγματα που συλλέχθηκαν μεταξύ 3 και 14 ημερών μετά την εκμετάλλευση (DPI) στην ομάδα IM και 100% (10/10) για δείγματα που συλλέχθηκαν μεταξύ 3 και 7 ημερών μετά την εκτόξευση (DPI) στην ομάδα. Ωστόσο, το ποσοστό επιτυχίας μειώθηκε σταδιακά στις 14 ημέρες μετά τη μετατόπιση (70%), 21 ημέρες μετά τη φυλακή (55,6%) και 28 ημέρες μετά τη μετατόπιση (12,5%).

Σχήμα 5. Τρία στελέχη μολυσματικών ιών απομονώθηκαν επιτυχώς από δείγματα σάλιο που συλλέχθηκαν και από τα δύο μολυσμένα ζώα σε 3 ημέρες μετά τη μόλυνση (DPI) μετά από δύο περάσματα καλλιέργειας. Κανένας μολυσματικός ιός δεν απομονώθηκε από ρινικά ή ορθικά επιχρίσματα.

6. Οι αποκρίσεις κυτοκίνης που προκαλούνται από τη μόλυνση PRRSV-1 LLEIDA 029_22

Τα δείγματα ορού συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια των πρώτων 14 ημερών μετά τη μόλυνση για να εκτιμηθούν τα επίπεδα κυτοκίνης, αποκαλύπτοντας σημαντικές διαφορές μεταξύ των τριών ομάδων (Σχήμα 6). Τα επίπεδα IFN-α αυξήθηκαν σημαντικά και στις δύο ομάδες μόλυνσης στις 3, 7 και 14 ημέρες μετά τη μόλυνση (DPI), με επίπεδα IFN-α στην ομάδα IM σημαντικά υψηλότερα από ό, τι στην ομάδα στις 14 ημέρες μετά τη μόλυνση (P <0,05). Οι προφλεγμονώδεις κυτοκίνες IL-1α, IL-12 και IL-6 έδειξαν παρόμοιες τάσεις: η IL-1α αυξήθηκε στην ομάδα σε 3 ημέρες μετά τη μόλυνση και παρέμεινε σταθερά, ενώ τα επίπεδα IL-6 στην ομάδα IM ήταν σημαντικά υψηλότερα από ό, τι στην ομάδα ελέγχου στις 7 και 14 ημέρες μετά τη μόλυνση (Εικόνα 6Β, DE). Ιδιαίτερα σημείωση, τα επίπεδα IL-6 ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα IM από ό, τι στην ομάδα IN σε 14 ημέρες μετά τη μόλυνση (p <0,05). Η IL-1β και στις δύο ομάδες μολυσμένων ζώων έδειξε μια αυξανόμενη τάση, με την ομάδα IM να δείχνει σημαντικά υψηλότερα επίπεδα από την ομάδα ελέγχου στα 3, 7 και 14 dpi, ενώ η ομάδα στην ομάδα έδειξε σημαντική διαφορά μόνο σε 14 dpi (Εικόνα 6C).

Το σχήμα 6. Τα επίπεδα IL-12 ήταν σημαντικά υψηλότερα στην ομάδα IM από ό, τι στην ομάδα IN και στην ομάδα ελέγχου στα 14 dpi (Σχήμα 6F). Η συνολική τάση έδειξε μια ισχυρότερη προ-φλεγμονώδη απόκριση κυτοκίνης στην ομάδα IM, ιδιαίτερα σε επίπεδα IL-6 στα 7 και 14 dpi, η οποία συσχετίστηκε θετικά με το ποσοστό θνησιμότητας 100% στην ομάδα IM.

7. Ειδικές και εξουδετερωτικές αποκρίσεις αντισωμάτων σε ζώα που έχουν μολυνθεί με PRRSV-1 Lleida 029_22

Τα αντισώματα PRRSV-1 και PRRSV-2 αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας εμπορικά κιτ ELISA (Εικόνα 7Α). Η ορομετατροπή εμφανίστηκε στο 70% των ζώων στην ομάδα IM και στο 90% των ζώων στην ομάδα IN στα 14 dpi. Ο λόγος S/P και στις δύο ομάδες ήταν σημαντικά υψηλότερος από εκείνον της ομάδας ελέγχου (P <0,05). Τα επίπεδα αντισωμάτων στην ομάδα άρχισαν να μειώνονται στα 21 dpi, παρέμειναν σταθερά σε 42 dpi, ανέκαμψαν στα 56 dpi και στη συνέχεια μειώθηκαν ελαφρώς στα 63 dpi. Η ομάδα ελέγχου παρέμεινε οροαρνητικό σε όλο το πείραμα (S/P <0,4).

Εικόνα 7. Η εξουδετέρωση των δοκιμών αντισωμάτων έδειξε ότι στην ομάδα IN, ανιχνεύθηκε μόνο ένας χαμηλός τίτλος 2 log₂ στα 28 dpi, ο οποίος στη συνέχεια αυξήθηκε σταδιακά σε 3,71 log₂ σε 56 dpi (Εικόνα 7Β). Οι τίτλοι αντισωμάτων ποικίλλουν μεταξύ των ατόμων το ίδιο χρονικό σημείο και η εμφάνιση εξουδετερωτικών αντισωμάτων συμπίπτει με την κάθαρση του μολυσματικού ιού από τον ορό μετά από 28 dpi (Σχήμα 4Β). Δεν εντοπίστηκαν αντισώματα εξουδετέρωσης στην ομάδα ελέγχου.

8. Ανίχνευση και απομόνωση του PRRSV-1 LLEIDA 029_22 σε ομογενοποιητικά ιστών

Το RT-qPCR χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση των ιικών φορτίων σε διάφορους ιστούς (Σχήμα 4F). Στην ομάδα IM, τα ιικά φορτία ήταν σχετικά συνεπή μεταξύ των ιστών, με τα υψηλότερα φορτία στους πνεύμονες, τους μεσοθωρακικούς λεμφαδένες και τον σπλήνα. Στην ομάδα, τα ιικά φορτία ποικίλλουν σημαντικά μεταξύ των ιστών, με τα υψηλότερα φορτία στις αμυγδαλές και τους μεσοθωρακικούς λεμφαδένες. Όπως αναμενόταν, το συνολικό ιικό φορτίο στην ομάδα ήταν χαμηλότερη από εκείνη της ομάδας IM, η οποία μπορεί να σχετίζεται με τον διαφορετικό χρόνο της νεκροψίας. Η σημαντική μεταβλητότητα των φορτίων ιστών σε μολυσμένα ζώα στην ομάδα IN συσχετίστηκε επίσης με διαφορετικούς χρόνους θανάτου (δείγματα γκρίζα σε 12, 21 και 43 dpi έναντι 63 dpi). Δεν ανιχνεύθηκε ιικό RNA σε οποιοδήποτε δείγμα ιστού από την ομάδα ελέγχου.

Πίνακας 1. Οι ιστοί που συλλέχθηκαν από ζώα που πέθαναν στις 12, 21 ή 43 ημέρες μετά τη μόλυνση δοκιμάστηκαν θετικά για το AVI.

(Πίνακας Σημείωση: Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τα αποτελέσματα της απομόνωσης RT-qPCR και του ιού από δείγματα ιστών.

9. Παθολογική και ανοσοϊστοχημική ανάλυση των ιστών μολυσμένων με PRRSV

Τα ευρήματα της νεκροψίας: Τα ζώα που πέθαναν μετά από μόλυνση με PrRSV (ιδιαίτερα εκείνα που πέθαναν μεταξύ 12 και 21 ημερών μετά τη μόλυνση) έδειξαν σημαντικές συστηματικές βλάβες, συμπεριλαμβανομένης της πορφυρικής δέρματος, γενικευμένου οίδημα, σοβαρής λεμφαδενοπάθειας, σπληνομεγαλίας (μερικές φορές με ωοθυλακική υπερπλασία) και γαστρικής αιμορραγίας. Οι πνευμονικές αλλοιώσεις ήταν εμφανείς, επιδεικνύοντας μερική κατάρρευση, πολυεστιακή ενοποίηση και κοκκινωπό-καφέ πλευρές, σύμφωνα με την ενδιάμεση πνευμονία, με πιο σοβαρές βλάβες σε ζώα που πέθαναν νωρίς (Εικόνα 8Α). Περίπου το 20% των ζώων με ενδορινική λοίμωξη ανέπτυξε επίσης αποστήματα, περικαρδίτιδα και αρθρίτιδα που προκαλείται από δευτερογενή βακτηριακή λοίμωξη. Δεν παρατηρήθηκαν ακαθάριστες βλάβες στα ζώα ελέγχου.

Το σχήμα 8. Η ιστοπαθολογική ανάλυση έδειξε ότι οι διαστρεβτιβικές βαθμολογίες πνευμονίας σε ζώα που πέθαναν νωρίς (12-21 dpi) στο IM και σε ομάδες κυμαίνονταν από 1,83 έως 3,33 μονάδες. Ωστόσο, αυτές οι βαθμολογίες μειώθηκαν σημαντικά σε ζώα που θυσιάστηκαν σε 63 dpi (ομάδα ελέγχου, 0.17-0.83 σημεία, σε ομάδα, 0.50-1.17 βαθμοί). Ιδιαίτερα σημείωση, η ιστολογική βαθμολογία των αμυγδαλών στην ομάδα ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη της ομάδας ελέγχου στα 63 dpi (p <0,05), αλλά δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε άλλους ιστούς (Σχήμα 8C).

(Λεζάντα: Το σχήμα 8b δείχνει τις ιστοπαθολογικές βαθμολογίες και το Σχήμα 8C συγκρίνει τις ιστολογικές βαθμολογίες των διαφόρων ομάδων στα 63 dpi)

Η μικροσκοπική παθολογία αποκάλυψε τη διάμεση πνευμονία (πάχυνση του κυψελιδικού τοιχώματος, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη διήθηση των φλεγμονωδών κυττάρων) στους πνεύμονες όλων των μολυσμένων ζώων. Οι εκκρίσεις και ο νεκρωτικός ιστός ήταν παρόντες εντός των κυψελίδων, μαζί με σημάδια αγγειακής βλάβης. Ο λεμφοειδής ιστός (λεμφαδένες και σπλήνα) έδειξε σοβαρή λεμφοπενία και νέκρωση, συνοδευόμενη από αγγειακή βλάβη (π.χ. θρόμβωση και αγγειίτιδα). Παρατηρήθηκαν περιαγγειακά φλεγμονώδη κυτταρική διήθηση, οίδημα και γλοίωση στην λευκή ύλη του εγκεφάλου (Σχήμα 9Α).

Η ανάλυση ανοσοϊστοχημικής (IHC) ανίχνευσε τα αντιγόνα PRRSV σε μακροφάγα και περιστασιακά σε πνευμοκύτταρα τύπου II, από τους πνεύμονες, τους λεμφαδένες, τις αμυγδαλές και τους σπλήνες μολυσμένων ζώων (Σχήμα 9Β). Τα ιικά αντιγόνα ανιχνεύθηκαν επίσης σε περιαγγειακά φλεγμονώδη κύτταρα στον εγκέφαλο.

Το σχήμα 9. Η μόλυνση PRRSV προκαλεί εκτεταμένη παθολογική βλάβη στους πνεύμονες, τους λεμφοειδείς ιστούς και τον εγκέφαλο, που εντοπίζονται κυρίως εντός μακροφάγων, παρουσιάζοντας συστηματικά παθολογικά χαρακτηριστικά.

Συζήτηση

Το PRRSV έχει περιορισμένο τροπισμό για μονοκυτταρικές κυτταρικές σειρές και παραδοσιακά απομονώθηκε και καλλιεργηθεί χρησιμοποιώντας κυψελιδικά μακροφάγα (PAMs) και κύτταρα Marc-145. Ωστόσο, οι PAMs είναι δύσκολο να ληφθούν και να έχουν μεγάλη μεταβλητότητα παρτίδας σε παρτίδα και είναι δύσκολο να προσαρμοστούν τα στελέχη υψηλής παθογόνου στελέχους στο Marc-145. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήσαμε την αθανατοποιημένη κυτταρική σειρά Pam-Knu, η οποία είναι ευαίσθητη σε ορισμένα στελέχη πεδίου, αντί για PAMs. Απομονώσαμε με επιτυχία το στέλεχος Lleida 029_22, της οποίας η καμπύλη ανάπτυξης ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε στα PAMs. Επί του παρόντος, δεν υπάρχει καθολική κυτταρική σειρά κατάλληλη για όλα τα στελέχη PRRSV και απαιτούνται μελλοντικές προσπάθειες για τον εντοπισμό πιο κατάλληλων κυτταρικών γραμμών για την απομόνωση διαφορετικών στελεχών.

Σύναψη

Η μελέτη αυτή καθιέρωσε επιτυχώς ένα μοντέλο ενδορινικής λοίμωξης με ένα εξαιρετικά μολυσματικό στέλεχος PRRSV-1. Οι κλινικές εκδηλώσεις (υψηλή θνησιμότητα, έντονα συμπτώματα, επίμονος υψηλός πυρετός και ιρεμία) μοιάζουν πολύ με εκείνα που παρατηρούνται σε εστίες πεδίου. Το βασικό εύρημα ήταν ότι η οδός μόλυνσης επηρέασε σημαντικά το αποτέλεσμα: η ενδομυϊκή (IM) μόλυνση είχε ως αποτέλεσμα 100% οξεία θνησιμότητα, ενώ η ενδορινική (σε) μόλυνση είχε ποσοστό θνησιμότητας μόνο 30% και οι μολυσμένοι χοίροι τελικά ανακτήθηκαν εντελώς πλήρως. Αυτή η σημαντική διαφορά υπογραμμίζει τον κίνδυνο ότι οι πρακτικές έγχυσης IM στο αγρόκτημα θα μπορούσαν να επιδεινώσουν σημαντικά τη σοβαρότητα της επιδημίας μέσω της νοσοκομειακής μετάδοσης.