wiadomości o firmie Wirus zespołu rozrodczego i oddechowego świń typu 1 jest bardzo zjadliwy u świń

Zespół rozrodczy i oddechowy świń (PRRS) pozostaje jedną z najważniejszych chorób zakaźnych, które dotykają światowego przemysłu wieprzowego.Niedawne pojawienie się wysoce chorobotwórczego szczepu PRRSV-1 w północno-wschodniej Hiszpanii (po raz pierwszy wykryte w 2020 r.) stwarza nowe wyzwania w zakresie kontroli choroby.Chociaż te szczepy są niszczycielskie w terenie, ich kompleksowa eksperymentalna charakterystyka nie została jeszcze w pełni zbadana.W tym badaniu systematycznie zbadano pochodzenie genetyczne, właściwości replikacji in vitro i mechanizmy patogenności nowo pojawionego, wysoce patogennego szczepu PRRSV-1 w Hiszpanii, Lleida 029_22,poprzez podwójne szlaki zakażenia (wewnątrzmięśniowe i wewnątrznasowe).

Niedawne badanie opublikowane w Wiley Online Library przeanalizowało genetyczne cechy i patogenność wysoce patogennego szczepu PRRSV-1 Lleida 029_22 u świń.Analiza filogenetyczna wykazała, że szczep Lleida 029_22 należy do nowego kladu związanego z epidemią PRRSV-1 Rosalia i jest homologiczny z wysoce zjadliwym włoskim szczepem PR40Szczep ten skutecznie rozmnaża się w macrophagach alveolarnych świń i komórkach PAM-KNU in vitro, ale nie w komórkach MARC-145.

W celu oceny jego patogenności, ośmiotygodniowe prosięta zostały zaszczepione taką samą dawką 2×105 TCID5 Lleida 029_22 wstrzyknięciem do mięśni (IM) i do nosa (IN).Szczepienie wewnątrzustrojowe spowodowało 100% śmiertelności w ciągu 14 dni.W przeciwieństwie do tego, u pacjentów, u których występuje silna wiremia, wysokie wydzielanie wirusów, znacznie podwyższony poziom cytokin prozapalnych (zwłaszcza IL- 6) i ciężkie zmiany płuc,u świń zaszczepionych szczepionką IN odnotowano niższy wskaźnik śmiertelności (30%) i umiarkowane objawy kliniczneOsoby, które przeżyły, wyzdrowiały po 63 dniach, ale wykazywały długotrwałą wiremię i wydzielanie, a także niskie poziomy cytokin prozapalnych i przeciwciał neutralizujących od 28 dnia.

Co ciekawe, IN Infection wiernie podsumował objawy epidemii wywołanej przez wysoce zaraźliwy szczep Rosalii na hiszpańskich farmach,w czasie gdy zakażenie układem pokarmowym podkreślało ryzyko transmisji nosocomialnej.

Historia: wirus zespołu rozrodczego i oddechowego świń (PRRSV) jest głównym patogenem zagrażającym światowemu przemysłowi wieprzowemu.Jego duża zmienność i różnorodność sprawiają, że istniejące szczepionki są niekonsekwentnie skuteczne.W 2020 r. w Hiszpanii pojawił się wysoce zaraźliwy szczep PRRSV-1 o nazwie "Rosalia" i szybko się rozprzestrzenił, powodując poważne straty (np. zwiększona śmiertelność w okresie wegetacji).Analiza genetyczna sugeruje, że najprawdopodobniej powstała z wysoce zaraźliwego włoskiego szczepuTen szczep powoduje wysokie wskaźniki aborcji i śmiertelności (> 20%) w terenie, ale brakuje systematycznych danych eksperymentalnych.

Cele i metody badania: Niniejsze badanie miało na celu kompleksową charakterystykę szczepu PRRSV-1, który jest wysoce zaraźliwy i który został odizolowany z ogniska Rosalia, przy użyciu eksperymentów in vitro i in vivo.Ośmiotygodniowe prosiątki zostały zaszczepione zarówno drogą wewnątrzmięśniową (IM), jak i intranasalną (IN) (IM jest powszechnie stosowaną drogą eksperymentalną)., podczas gdy IN symuluje naturalną infekcję).

Cele badań: szczegółowa dokumentacja objawów klinicznych i śmiertelności; badania patologiczne, mikroskopowe i immunohistochemiczne świń zmarłych/niepoddanych sekcji zwłok; obciążenie wirusowe w surowicy,śliny, wymazów z nosa, wymazów z odbytnicy i tkanek, a także izolacji wirusa, zostały wykonane w celu zrozumienia dynamiki wirusa i przenoszenia się;W celu oceny stężenia przeciwciał przeciwprzewodowych, które są specyficzne dla PRRSV i neutralizujące antyciała przeciwprzewodowe, a także stężenia cytokin w surowicy.

Kluczowe znaczenie: Badanie to dostarczy kluczowego modelu eksperymentalnego i podstawy danych do oceny skuteczności istniejących szczepionek, opracowania nowych szczepionek,i dalszego zrozumienia patogenezy tego wysoce zaraźliwego szczepu.

Wyniki

1Analiza filogenetyczna szczepów PRRSV-1 i charakterystyka sekwencji aminokwasów Nsp2

Charakterystyka genomowa i pozycjonowanie filogenetyczne

Głębokie sekwencjonowanie (286×) potwierdziło, że genom szczepu PRRSV-1 Lleida 029_22 ma długość 14,858 nt (rysunek 1A), należący filogenetycznie do linii podtypu 1 PRRSV-1.Szczep ten tworzy niezależną klasę od trzech innych szczepów Rosalia związanych z wybuchem (rysunek 1A), ma identyczność nukleotydową 96, 61% - 97, 26%, i jest homologiczny z wysoce patogennym szczepem PR40.

Charakterystyka usunięcia Nsp2:

Białko Nsp2 ze szczepu Lleida 029_22 wykazuje delecję 63 aminokwasów (pozycje 317-379 w stosunku do szczepu Lelystad) (rysunek 1B).podczas gdy delecja w jego homologicznym szczepie, PR40, jest jeszcze większa (rysunek 1A), co sugeruje, że ta zmiana genetyczna pojawiła się na początku ewolucji kladu.

Rysunek 1. Drzewo filogenetyczne szczepu PRRSV-1 Lleida 029_22 i sekwencja Nsp2
(A) Maksymalne prawdopodobieństwo drzewa filogenetycznego skonstruowanego na podstawie całej sekwencji genomu (model GTR, 1000 testów bootstrap).

▲: szczep Lleida 029_22 stosowany w tym badaniu; ●: szczep związany z wybuchem Rosalia.
(B) Częściowe wyrównanie sekwencji aminokwasów Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).

Porównane szczepy: szczep Lleida 029_22, szczep Rosalia związany z epidemią, bardzo zaraźliwy szczep PR40 i prototyp szczepu Lelystad.
*Uwaga: Nsp2, białko niestrukturalne 2; PRRSV-1, wirus zespołu rozrodczego i oddechowego świń typu 1.

2Charakterystyka replikacji in vitro szczepu PRRSV-1 Lleida 029_22

Po pierwsze, właściwości replikacyjne szczepu Lleida 029_22 oceniano in vitro. Szczep ten skutecznie replikował się w komórkach PAM i PAM-KNU, ale nie w komórkach MARC-145 (rysunek 2A).Krzywy wzrostu wirusa w trzech typach komórek wykazywały podobne tytry wirusowe w komórkach PAM i PAM- KNUPo 72 godzinach oba typy komórek osiągnęły wirusowe tytry około 105TCID50/ ml.Komórki MARC-145 nie były w stanie utrzymać skutecznej infekcji wirusowejPo 72 godzinach poziom wirusa spada do poziomu niewykrywalnego.

Rysunek 2. Kinetyka wzrostu PRRSV-1 Lleida 029_22 w trzech liniach komórkowych
(A) Mikroskopia fluorescencyjna 72 godziny po zakażeniu (MOI = 0.1, barwienie przeciwciałem przeciw białkowi N; 20x cel)
(B) Dynamika tytułów wirusowych w komórkach PAM-KNU (średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów)
*Uwaga: MOI, wielokrotność zakażenia; PAM, pierwotne makrofagi alweolare; PRRSV-1, wirus zespołu rozrodczego i oddechowego świń typu 1.

3. Objawy kliniczne i śmiertelność u świń zakażonych Lleida 029_22

Patogenność PRRSV-1 Lleida 029_22 oceniano drogą szczepień do mięśni (IM) i do nosa (IN). Świnie w grupie IM wykazywały wzrost temperatury ciała począwszy od 1 dpi,o temperaturze przekraczającej 41°C przy 7 dpiW grupie otrzymującej szczepionkę przez nos wystąpiła łagodniejsza gorączka, która tylko przez krótki czas przekroczyła 41°C po 5 dniach od szczepienia, a następnie wystąpiła przerywana gorączka.W grupie kontrolnej nie występowały zaburzenia temperatury ciała w trakcie całego eksperymentu (rysunek 3A)..

Obserwacje kliniczne wykazały, że grupa zakażona IM doświadczyła ostrego zaburzenia oddychania, objawów neurologicznych, ciężkiej duszności i cyanozy uszu i moszny,w grupie zakażonej IN występowała głównie umiarkowanaDodatkowe objawy kliniczne obejmowały szarpanie futra, obrzęk (najbardziej wyraźny w kończyniach i szyi), zapalenie stawów i ogólne pogorszenie stanu ciała w obu grupach,ale były one poważniejsze w grupie IMTe ciężkie objawy kliniczne koncentrowały się głównie w okresie od 12 do 14 dni po szczepieniu, zgadzając się z okresem wysokiej śmiertelności lub eutanazji z powodów socjalnych.

Ogólnie rzecz biorąc, wyniki kliniczne w grupie zakażonej IM były znacznie wyższe niż w grupie zakażonej IN po 11, 12 i 14 dniach od szczepienia (p < 0, 05),szczyt 14 dni po szczepieniu (rysunek 3B)W grupie IN wyniki kliniczne były niższe, osiągając szczyt po 13 dniach od zakażenia (dpi).ale wyniki pozostały znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej (p < 0).W grupie kontrolnej nie zaobserwowano żadnych objawów klinicznych w trakcie całego eksperymentu (rysunek 3B).

Linear mixed model analysis (accounting for the non-independence of observations from the same animal at different time points) revealed that group- and day-specific variables significantly influenced body temperature and clinical scores during the first 14 days (p < 0Znaczące różnice stwierdzono między grupami IM i IN, a także między grupami zakażonymi i grupą kontrolną.

Analiza przeżycia wykazała, że wszystkie zwierzęta w grupie zakażonej IM zmarły przed 14 dni po zakażeniu, przy 100% śmiertelności.Śmierci naturalne lub wywołane koncentrowały się w okresie od 12 do 14 dni po zakażeniu.W grupie zakażonej IN śmiertelność wynosiła 30% po 63 dniach od zakażenia, a zgony występowały po 12, 21 i 43 dniach od zakażenia.Wszystkie zwierzęta w grupie kontrolnej przetrwały do końca eksperymentu (rysunek 3C).

Rysunek 3. Wyniki kliniczne u świń zakażonych PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) Codzienne temperatury odbytnicy po zakażeniu (czerwona linia drukowana: progi gorączki > 41°C; średnia ± SD)
B) Średnia dzienna wynik kliniczny (średnia ± SD; identyczne litery nie wskazują na istotne różnice między grupami, p < 0,05)
C) Krzywy przeżycia w grupach eksperymentalnych
Uwaga: C, grupa kontrolna; IM, grupa do mięśni; IN, grupa do nosa.

4Wiremia i wydzielanie wirusów u zwierząt zakażonych PRRSV

Poziom wiremii po zakażeniu wirusem PRRSV-1 Lleida 029_22 oceniano metodą RT- qPCR.z znaczącymi różnicami między grupami IM i IN w porównaniu z grupą kontrolną, który pozostał ujemny (p < 0.05W grupie IN wiremia osiągnęła szczyt po 7 dniach od zakażenia,w grupie IM były znacznie wyższe niż w grupie IN i grupie kontrolnej zarówno po 7 jak i 14 dniach od zakażenia (p < 0).Następnie obciążenie wirusowe w grupie IN stopniowo zmniejszało się, ale nadal było znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej, wynoszącej 28 dpi.

Rysunek 4. Wyrzuty wirusowe oceniano za pomocą wymazów z śliny i nosa/odbytu. Wszystkie zakażone zwierzęta wykazały się pozytywnie na wirusa w 3 dpi w wymazach z śliny, nosa i odbytu.

W grupie IM wydzielanie śliny trwało do 14 dpi i do końca eksperymentu w grupie IN (szczyt 3 dpi; rysunek 4B).

Wytrysk z nosa osiągnął szczyt 7 dpi w obu grupach, a obciążenie wirusowe w grupie IM było znacznie wyższe w grupie 7/14 dpi niż w grupie IN (*p<0.05; rys. 4C).

W grupie IM wydzielanie odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbytów odbyt

Analiza AUC potwierdziła, że obciążenie wirusowe we wszystkich próbkach z grup zakażonych było znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej,i że obciążenia wymazami z nosa w grupie IM były wyższe niż w grupie IN (*p<0.05). Podsumowując, wydzielanie PRRSV następuje we wczesnym okresie i utrzymuje się po zakażeniu.

5. Weryfikacja izolacji zakaźnego PRRSV z próbek RT-qPCR-pozytywnych

W celu potwierdzenia obecności wirusa zakaźnego w próbkach z dodatkiem RT-qPCR przeprowadzono eksperymenty izolacji wirusa (VI) z wykorzystaniem komórek PAM-KNU (rysunek 5). the success rate of virus isolation was 100% (10/10) for samples collected between 3 and 14 days post-inoculation (dpi) in the IM group and 100% (10/10) for samples collected between 3 and 7 days post-inoculation (dpi) in the IN groupJednakże wskaźnik sukcesu stopniowo zmniejszał się po 14 dniach po szczepieniu (70%), 21 dniach po szczepieniu (55,6%) i 28 dniach po szczepieniu (12,5%).

Rysunek 5. Trzy szczepy wirusa zakaźnego zostały z powodzeniem wyizolowane z próbek śliny pobranych od obu zakażonych zwierząt 3 dni po zakażeniu (dpi) po dwóch przejściach kultury.Żaden wirus zakaźny nie został wyizolowany z wymazów z nosa lub odbytu.

6. Odpowiedzi cytokinowe wywołane zakażeniem PRRSV-1 Lleida 029_22

W ciągu pierwszych 14 dni po zakażeniu pobrano próbki surowicy w celu oceny poziomu cytokin, co wykazało istotne różnice między trzema grupami (rysunek 6).Poziom IFN- α był znacząco podwyższony w obu grupach zakażonych po 3, 7 i 14 dni po zakażeniu (dpi), przy czym poziom IFN- α w grupie IM był znacznie wyższy niż w grupie IN po 14 dniach od zakażenia (p<0, 05).i IL-6 wykazywały podobne tendencje: IL- 1α wzrosła w grupie IN 3 dni po zakażeniu i pozostała stabilna,w grupie IM były znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej po 7 i 14 dniach od zakażenia (rysunek 6B).Należy zwrócić szczególną uwagę na to, że stężenie IL- 6 było znacznie wyższe w grupie IM niż w grupie IN po 14 dniach od zakażenia (p<0, 05).IL- 1β w obu grupach zakażonych zwierząt wykazało rosnącą tendencjęW grupie IM występowały znacznie wyższe niż w grupie kontrolnej stężenia w 3, 7 i 14 dpi, podczas gdy w grupie IN występowała znacząca różnica tylko w 14 dpi (rysunek 6C).

Rysunek 6. Poziomy IL-12 były znacznie wyższe w grupie IM niż w grupie IN i grupie kontrolnej w 14 dpi (rysunek 6F).Ogólny trend wykazał silniejszą prozapalną odpowiedź cytokin w grupie IMW grupie IM stwierdzono pozytywną korelację z 100% śmiertelnością.

7Specyficzne i neutralizujące odpowiedzi przeciwciał u zwierząt zakażonych PRRSV-1 Lleida 029_22

Przeciwciała specyficzne dla PRRSV-1 i PRRSV-2 oceniano przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA (rysunek 7A).Serokonwersja wystąpiła u 70% zwierząt z grupy IM i u 90% zwierząt z grupy IN w 14 dpi.Poziom przeciwciał w grupie IN zaczął spadać na poziomie 21 dpi, pozostał stabilny na poziomie 42 dpi,odbił się przy 56 dpiW grupie kontrolnej obserwowano seronegatywność przez cały czas eksperymentu (S/P < 0, 4).

Rysunek 7. Badania antyciał neutralizujących wykazały, że w grupie IN wykryto tylko niski tytuł 2 log2 przy 28 dpi, który następnie stopniowo wzrósł do 3,71 log2 przy 56 dpi (rysunek 7B).Tytry przeciwciał różniły się w zależności od jednostki w tym samym momencie.W grupie kontrolnej nie wykryto przeciwciał neutralizujących..

8. wykrywanie i izolacja PRRSV-1 Lleida 029_22 w homogenatach tkankowych

RT-qPCR wykorzystano do pomiaru obciążeń wirusowych w różnych tkankach (rysunek 4F).węzły chłonne pośrodkoweW grupie IN, obciążenia wirusowe znacząco różniły się w różnych tkankach, z najwyższym obciążeniem migdałek i mediastynalnych węzłów chłonnych.całkowita obciążenie wirusowe w grupie IN było niższe niż w grupie IM, co może być związane z różnym czasem sekcji.Znacząca zmienność obciążeń tkankowych u zakażonych zwierząt w grupie IN wiązała się również z różnymi czasami śmierci (próbki zestarzałymi w wieku 12 dni po zabiegu).Nie wykryto żadnego wirusowego RNA w żadnej próbce tkanki z grupy kontrolnej.

Tabela 1. Tkanki zebrane od zwierząt, które zmarły po 12, 21 lub 43 dniach od zakażenia, wykazały pozytywny wynik w przypadku aVI.

(Uwaga w tabeli: Tabela 1 podsumowuje wyniki RT-qPCR i izolacji wirusa z próbek tkanek. "MLN" oznacza mediastynalne węzły chłonne, a "ILN" węzły chłonne podbródkowe.)

9Patologiczna i immunohistochemiczna analiza tkanek zakażonych PRRSV

Wyniki sekcji zwłok: zwierzęta, które zmarły po zakażeniu wirusem PRRSV (zwłaszcza te, które zmarły w okresie od 12 do 21 dni po zakażeniu) wykazywały znaczące zmiany układowe, w tym purpurową skórę,ogólny obrzęk, ciężka limfadenopatia, splenomegalia (czasami wraz z hiperplazją pęcherzową) i krwotok żołądkowy.i czerwono-brązowe plamy, co jest zgodne z zapaleniem płuc międzykręgowym, z cięższymi zmianami u zwierząt, które zmarły wcześnie (rysunek 8A).zapalenie sercaU zwierząt kontrolnych nie zaobserwowano poważnych zmian.

Rysunek 8. Analiza histopatologiczna wykazała, że wyniki zapalenia płuc wśród zwierząt, które zmarły wcześnie (12-21 dpi) w grupach IM i IN wahały się od 1,83 do 3,33 punktu.W przypadku zwierząt poddanych ubojowi w 63 dpi (grupa kontrolna) wyniki te znacząco się zmniejszyły.Należy zwrócić szczególną uwagę na to, że wynik histologiczny migdałek w grupie IN był znacznie wyższy niż w grupie kontrolnej, wynosząc 63 dpi (p< 0, 05),ale nie zaobserwowano istotnych różnic w innych tkankach (rysunek 8C).

(Przepis: na rysunku 8B przedstawiono wyniki histopatologiczne, a na rysunku 8C porównano wyniki histologiczne różnych grup w poziomie 63 dpi)

Patologia mikroskopowa wykazała zapalenie płuc międzykręgowe (gęstnienie ścian pęcherzowych, proliferacja komórek i infiltracja komórek zapalnych) w płucach wszystkich zakażonych zwierząt.W alweolach zaobserwowano wydzielinę i tkankę martwą.W tkance chłonnej (węzły chłonne i śledziona) wystąpiła ciężka limfopenia i martwica, towarzysząca uszkodzeniu naczyń (np. zakrzep i zapalenie naczyń).Infiltracja komórek zapalnych w okolicach naczyń, obrzęk i gliosa w białej materii mózgu (rysunek 9A).

Analiza immunohistochemiczna (IHC) wykryła antygeny PRRSV w makrofagach, a czasami w pneumocytach typu II, z płuc, węzłów chłonnych, migdałek i śledziony zakażonych zwierząt (rysunek 9B).Antygeny wirusowe wykryto również w komórkach zapalnych okołozapalnych w mózgu.

Rysunek 9. Zakażenie PRRSV powoduje rozległe uszkodzenia patologiczne w płucach, tkankach chłonnych i mózgu, głównie zlokalizowane w makrofagach, wykazujące objawy patologiczne ogólnoustrojowe.

Rozmowa

PRRSV ma ograniczony tropizm dla linii komórkowych monocytowych i tradycyjnie jest izolowany i hodowany przy użyciu makrofagów alweolacyjnych (PAM) i komórek MARC-145.PAM są trudne do uzyskania i mają dużą zmienność w zależności od seriiW tym badaniu zamiast PAMs użyliśmy nieśmiertelnej linii komórkowej PAM-KNU, która jest wrażliwa na niektóre szczepy pola.Udało nam się wyizolować szczep Lleida 029_22Obecnie nie istnieje uniwersalna linia komórkowa odpowiednia dla wszystkich szczepów PRRSV,i potrzebne są dalsze wysiłki w celu zidentyfikowania bardziej odpowiednich linii komórkowych do izolacji różnych szczepów.

Wniosek

W tym badaniu z powodzeniem ustalono model infekcji wewnątrznasowej ze szczepem PRRSV-1 o wysokiej wirulencji.i wiremii) bardzo przypominają te obserwowane w epidemiach polowych.Kluczowym ustaleniem było to, że droga zakażenia znacząco wpływa na wynik: zakażenie domięśniowe (IM) prowadziło do 100% ostrej śmiertelności,natomiast zakażenie wewnątrznasowe (IN) miało śmiertelność zaledwie 30%, a zainfekowane świnie ostatecznie całkowicie wyzdrowiały.Ta znacząca różnica podkreśla ryzyko, że praktyki wstrzykiwania IM w gospodarstwach mogłyby znacząco pogorszyć nasilenie epidemii poprzez transmisję nosocomialną..