돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)은 전 세계 돼지 산업에 영향을 미치는 가장 중요한 전염병 중 하나로 남아 있습니다. 최근 스페인 북동부 지역에서 고병원성 PRRSV-1 균주가 출현(2020년 처음 발견)하면서 질병 통제에 새로운 과제가 제시되었습니다. 이러한 독성이 강한 균주는 현장에서 치명적이지만, 포괄적인 실험적 특성 규명은 아직 완전히 연구되지 않았습니다. 따라서 본 연구에서는 새롭게 출현한 고병원성 스페인 PRRSV-1 균주 Lleida 029_22의 유전적 기원, 시험관 내 복제 특성 및 병원성 기전을 근육 내 및 비강 내 감염의 이중 경로를 통해 체계적으로 조사했습니다.
Wiley Online Library에 게재된 최근 연구에서는 돼지에서 고병원성 PRRSV-1 균주 Lleida 029_22의 유전적 특성과 병원성을 분석했습니다. 계통 발생학적 분석 결과 Lleida 029_22 균주는 PRRSV-1 Rosalia 발생과 관련된 새로운 계통에 속하며 고병원성 이탈리아 균주 PR40과 상동성이 있는 것으로 나타났습니다. 이 균주는 시험관 내 돼지 폐포 대식세포 및 PAM-KNU 세포에서 효율적으로 복제되지만 MARC-145 세포에서는 복제되지 않습니다.
병원성을 평가하기 위해 8주령 돼지에게 Lleida 029_22 2×10⁵ TCID⁵ 용량을 근육 내(IM) 및 비강 내(IN) 주사로 접종했습니다. IM 접종은 14일 이내에 100% 사망률을 보였으며, 높은 바이러스혈증, 높은 바이러스 배출, 염증성 사이토카인(특히 IL-6)의 현저한 증가, 심각한 폐 병변이 동반되었습니다. 반면, IN 백신을 접종한 돼지는 사망률이 낮았고(30%) 임상 증상이 중간 정도였습니다. 생존자는 63일 후에 회복되었지만, 28일 이후부터 바이러스혈증과 배출이 장기간 지속되었고, 염증성 사이토카인과 중화 항체의 수치가 낮았습니다.
흥미롭게도 IN 감염은 스페인 농장에서 고병원성 Rosalia 균주에 의해 발생한 발생의 임상 증상을 충실히 재현한 반면, IM 감염은 병원 내 전파의 위험성을 강조했습니다.
배경: 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)는 전 세계 돼지 산업을 위협하는 주요 병원체입니다. 높은 변이성과 다양성으로 인해 기존 백신의 효과가 일관적이지 않습니다. 2020년, "Rosalia"라는 고병원성 PRRSV-1 균주가 스페인에서 출현하여 빠르게 확산되어 심각한 손실(예: 성장기 사망률 증가)을 초래했습니다. 유전자 분석 결과, 이는 재조합을 통해 고병원성 이탈리아 균주 PR40에서 유래했을 가능성이 높습니다. 이 균주는 현장에서 높은 유산율과 사망률(>20%)을 유발하지만, 체계적인 실험 데이터는 부족합니다.
연구 목표 및 방법: 본 연구는 시험관 내 및 생체 내 실험을 사용하여 Rosalia 발생에서 분리된 고병원성 PRRSV-1 균주를 포괄적으로 특성화하는 것을 목표로 했습니다. 8주령 돼지에게 근육 내(IM) 및 비강 내(IN) 감염 경로를 통해 접종했습니다(IM은 일반적으로 사용되는 실험 경로이고, IN은 자연 감염을 시뮬레이션합니다).
검사 목표: 임상 증상 및 사망률에 대한 자세한 기록; 사망/부검 돼지의 육안, 현미경 및 면역조직화학적 병리학적 검사; 바이러스 역학 및 전파성을 이해하기 위해 혈청, 타액, 비강 면봉, 직장 면봉 및 조직의 바이러스 부하, 바이러스 분리; PRRSV 특이적 및 중화 항체 수준, 혈청 사이토카인 수준을 분석하여 면역 반응을 평가했습니다.
주요 의의: 본 연구는 기존 백신의 효능을 평가하고, 새로운 백신을 개발하며, 이 고병원성 균주의 병인 기전을 더 잘 이해하기 위한 핵심 실험 모델과 데이터 기반을 제공할 것입니다.
결과
1. PRRSV-1 균주의 계통 발생학적 분석 및 Nsp2 아미노산 서열 특성화
유전적 특성 및 계통 발생학적 위치:
심층 시퀀싱(286×)을 통해 PRRSV-1 Lleida 029_22 균주 게놈이 14,858 nt 길이임을 확인했으며(그림 1A), 계통 발생학적으로 PRRSV-1 아형 1 계통에 속합니다. 이 균주는 다른 세 개의 Rosalia 발생 관련 균주와 독립적인 계통을 형성하며(그림 1A), 96.61%-97.26%의 뉴클레오티드 동일성을 공유하고 고병원성 PR40 균주와 상동성을 보입니다.
Nsp2 결손 특성화:
Lleida 029_22 균주의 Nsp2 단백질은 63개의 아미노산 결손(Lelystad 균주 기준 317-379번 위치)을 나타냅니다(그림 1B). 이 결손은 Rosalia 계통 내에서 보존되는 반면, 상동 균주인 PR40의 결손은 훨씬 더 큽니다(그림 1A). 이는 이 유전적 변이가 계통 진화 초기에 발생했음을 시사합니다.
그림 1. PRRSV-1 Lleida 029_22 균주의 계통 발생수 및 Nsp2 서열 정렬
(A) 전체 게놈 서열을 기반으로 구성된 최대 우도 계통 발생수(GTR 모델, 1000 부트스트랩 테스트).
▲: 본 연구에 사용된 Lleida 029_22 균주; ●: Rosalia 발생 관련 균주.
(B) 부분 Nsp2 아미노산 서열 정렬(CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).
비교 균주: Lleida 029_22, Rosalia 발생 관련 균주, 고병원성 PR40 균주 및 프로토타입 Lelystad 균주.
*참고: Nsp2, 비구조 단백질 2; PRRSV-1, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 1형.
2. PRRSV-1 Lleida 029_22 균주의 시험관 내 복제 특성
먼저, Lleida 029_22 균주의 복제 특성을 시험관 내에서 평가했습니다. 이 균주는 PAM 및 PAM-KNU 세포에서 효율적으로 복제되었지만 MARC-145 세포에서는 복제되지 않았습니다(그림 2A). 세 가지 세포 유형에서 바이러스 성장 곡선은 PAM 및 PAM-KNU 세포에서 유사한 바이러스 역가를 보였지만, 후자에서는 약간 낮은 역가를 보였습니다(그림 2B). 72시간에 두 세포 유형 모두 약 10⁵TCID₅₀/mL의 바이러스 역가에 도달했습니다. 반면, MARC-145 세포는 효율적인 바이러스 감염을 유지할 수 없었으며, 72시간 후에 바이러스 역가가 감지할 수 없는 수준으로 떨어졌습니다.
그림 2. 세 가지 세포주에서 PRRSV-1 Lleida 029_22의 성장 역학
(A) 감염 후 72시간 형광 현미경 검사(MOI = 0.1, 항-N 단백질 항체 염색; 20x 대물렌즈)
(B) PAM-KNU 세포에서 바이러스 역가의 역학(세 번의 독립적인 실험의 평균 ± SD)
*참고: MOI, 감염 다중도; PAM, 일차 폐포 대식세포; PRRSV-1, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 1형.
3. Lleida 029_22에 감염된 돼지의 임상 증상 및 사망률
PRRSV-1 Lleida 029_22의 병원성은 근육 내(IM) 및 비강 내(IN) 접종 경로를 통해 평가했습니다. IM 그룹의 돼지는 1 dpi부터 체온이 상승하여 7 dpi에 41°C를 초과하고 13 dpi까지 지속되었습니다. 비강 내 접종 그룹은 미열을 보였으며, 접종 후 5일에 41°C를 잠시 초과한 후 간헐적인 발열 패턴을 보였습니다. 대조군은 실험 기간 동안 비정상적인 체온을 보이지 않았습니다(그림 3A).
임상 관찰 결과, IM 감염 그룹은 급성 호흡 곤란, 신경 증상, 심한 호흡 곤란 및 귀와 음낭의 청색증을 경험한 반면, IN 감염 그룹은 주로 중간 정도의 지속적인 호흡 곤란을 나타냈습니다. 추가적인 임상 증상으로는 털이 헝클어짐, 부종(사지와 목에서 가장 두드러짐), 관절 염증, 두 그룹 모두에서 전반적인 신체 상태 악화가 있었지만, IM 그룹에서 더 심했습니다. 이러한 심각한 임상 증상은 주로 접종 후 12~14일 사이에 집중되었으며, 이는 높은 사망률 또는 복지상의 이유로 안락사가 이루어진 기간과 일치했습니다.
전반적으로, IM 감염 그룹의 임상 점수는 접종 후 11, 12, 14일에 IN 감염 그룹보다 유의하게 높았으며(p < 0.05), 접종 후 14일에 최고점에 도달했습니다(그림 3B). IN 그룹의 임상 점수는 낮았으며, 감염 후 13일에 최고점에 도달했습니다(dpi). 그 후 증상이 점차 완화되었지만, 점수는 대조군보다 유의하게 높게 유지되었습니다(p < 0.05). 실험 기간 동안 대조군에서는 임상 증상이 관찰되지 않았습니다(그림 3B).
선형 혼합 모델 분석(동일한 동물의 서로 다른 시점에서의 관찰의 비독립성을 고려) 결과, 그룹 및 일별 변수가 처음 14일 동안 체온 및 임상 점수에 유의하게 영향을 미치는 것으로 나타났습니다(p < 0.05). IM 그룹과 IN 그룹 간, 그리고 두 감염 그룹과 대조군 간에 유의한 차이가 발견되었습니다.
생존 분석 결과, IM 감염 그룹의 모든 동물은 감염 후 14일 전에 사망했으며, 100% 사망률을 보였습니다. 자연사 또는 유도된 사망은 감염 후 12~14일에 집중되었습니다. IN 감염 그룹에서는 감염 후 63일까지 사망률이 30%였으며, 사망은 감염 후 12, 21, 43일에 발생했습니다. 대조군의 모든 동물은 실험 종료 시까지 생존했습니다(그림 3C).
그림 3. PRRSV-1 Lleida 029_22에 감염된 돼지의 임상 결과
(A) 감염 후 일일 직장 온도(빨간색 점선: 발열 임계값 >41°C; 평균 ± SD)
(B) 일일 평균 임상 점수(평균 ± SD; 동일한 문자는 그룹 간 유의한 차이가 없음을 나타냄, p < 0.05)
(C) 실험 그룹의 생존 곡선
참고: C, 대조군; IM, 근육 내 그룹; IN, 비강 내 그룹.
4. PRRSV 감염 동물의 바이러스혈증 및 바이러스 배출
PRRSV-1 Lleida 029_22 감염 후 바이러스혈증 수준은 RT-qPCR로 평가했습니다. PRRSV RNA는 감염된 모든 동물의 혈청에서 감염 후 3일에 검출되었으며, 음성이었던 대조군과 비교하여 IM 및 IN 그룹 간에 유의한 차이가 있었습니다(p < 0.05; 그림 4A). IN 그룹의 바이러스혈증은 감염 후 7일에 최고조에 달한 반면, IM 그룹의 바이러스 부하는 감염 후 7일과 14일 모두에서 IN 및 대조군보다 유의하게 높았습니다(p < 0.05). 그 후, IN 그룹의 바이러스 부하는 점차 감소했지만, 28 dpi에서 대조군보다 여전히 유의하게 높았습니다.
그림 4. 타액 및 비강/직장 면봉으로 바이러스 배출을 평가했습니다. 감염된 모든 동물은 타액, 비강 및 직장 면봉에서 3 dpi에 양성 반응을 보였습니다.
타액 배출은 IM 그룹에서는 14 dpi까지, IN 그룹에서는 실험 종료 시까지 지속되었습니다(3 dpi에서 최고점; 그림 4B).
비강 배출은 두 그룹 모두 7 dpi에 최고조에 달했으며, IM 그룹에서 7/14 dpi에 IN 그룹보다 유의하게 높은 바이러스 부하를 보였습니다(*p<0.05; 그림 4C).
직장 배출은 IM 그룹에서는 14 dpi까지, IN 그룹에서는 35 dpi까지 지속되었으며(56 dpi에 약간의 반등), 두 그룹 모두 7 dpi에 최고점을 보였습니다(그림 4D).
AUC 분석 결과, 감염된 그룹의 모든 샘플에서 바이러스 부하가 대조군보다 유의하게 높았으며, IM 그룹의 비강 면봉 부하가 IN 그룹보다 높았습니다(*p<0.05). 요약하면, PRRSV 배출은 감염 초기에 발생하여 지속됩니다.
5. RT-qPCR 양성 샘플에서 감염성 PRRSV 분리 확인
RT-qPCR 양성 샘플에서 감염성 바이러스의 존재를 확인하기 위해 PAM-KNU 세포를 사용하여 바이러스 분리(VI) 실험을 수행했습니다(그림 5). 혈청 샘플의 경우, IM 그룹에서 접종 후 3~14일(dpi) 사이에 수집된 샘플의 바이러스 분리 성공률은 100%(10/10)였고, IN 그룹에서 접종 후 3~7일(dpi) 사이에 수집된 샘플의 바이러스 분리 성공률은 100%(10/10)였습니다. 그러나 접종 후 14일(70%), 21일(55.6%), 28일(12.5%)에 성공률이 점차 감소했습니다.
그림 5. 두 번의 배양을 거친 후 감염된 두 동물 모두에서 감염 후 3일(dpi)에 수집된 타액 샘플에서 세 개의 감염성 바이러스 균주가 성공적으로 분리되었습니다. 비강 또는 직장 면봉에서는 감염성 바이러스가 분리되지 않았습니다.
6. PRRSV-1 Lleida 029_22 감염에 의해 유도된 사이토카인 반응
사이토카인 수준을 평가하기 위해 감염 후 처음 14일 동안 혈청 샘플을 수집하여 세 그룹 간에 유의한 차이를 나타냈습니다(그림 6). IFN-α 수준은 감염 후 3, 7, 14일에 두 감염 그룹 모두에서 유의하게 증가했으며, IM 그룹의 IFN-α 수준은 감염 후 14일에 IN 그룹보다 유의하게 높았습니다(p<0.05). 염증성 사이토카인 IL-1α, IL-12 및 IL-6은 유사한 경향을 보였습니다. IL-1α는 감염 후 3일에 IN 그룹에서 증가하여 안정적으로 유지되었고, IM 그룹의 IL-6 수준은 감염 후 7일과 14일에 대조군보다 유의하게 높았습니다(그림 6B, D-E). 특히, IL-6 수준은 감염 후 14일에 IM 그룹에서 IN 그룹보다 유의하게 높았습니다(p<0.05). 두 감염 동물 그룹의 IL-1β는 증가하는 경향을 보였으며, IM 그룹은 3, 7, 14 dpi에서 대조군보다 유의하게 높은 수준을 보였고, IN 그룹은 14 dpi에서만 유의한 차이를 보였습니다(그림 6C).
그림 6. IL-12 수준은 감염 후 14일에 IM 그룹에서 IN 그룹 및 대조군보다 유의하게 높았습니다(그림 6F). 전반적인 경향은 IM 그룹에서 더 강력한 염증성 사이토카인 반응을 보였으며, 특히 7 및 14 dpi에서 IL-6 수준이 높았으며, 이는 IM 그룹의 100% 사망률과 양의 상관관계를 보였습니다.
7. PRRSV-1 Lleida 029_22에 감염된 동물에서 특이적 및 중화 항체 반응
상업용 ELISA 키트를 사용하여 PRRSV-1 및 PRRSV-2 특이적 항체를 평가했습니다(그림 7A). 혈청 전환은 IM 그룹의 70%의 동물과 IN 그룹의 90%의 동물에서 14 dpi에 발생했습니다. 두 그룹의 S/P 비율은 대조군보다 유의하게 높았습니다(p < 0.05). IN 그룹의 항체 수준은 21 dpi에 감소하기 시작하여 42 dpi에 안정적으로 유지되었고, 56 dpi에 반등한 후 63 dpi에 약간 감소했습니다. 대조군은 실험 기간 동안 혈청 음성이었습니다(S/P < 0.4).
그림 7. 중화 항체 검사 결과, IN 그룹에서는 28 dpi에 2 log₂의 낮은 역가가 검출되었으며, 56 dpi에 3.71 log₂로 점차 증가했습니다(그림 7B). 항체 역가는 동일한 시점에서 개체 간에 다양했으며, 중화 항체의 출현은 28 dpi 이후 혈청에서 감염성 바이러스가 제거되는 시점과 일치했습니다(그림 4B). 대조군에서는 중화 항체가 검출되지 않았습니다.
8. 조직 균질액에서 PRRSV-1 Lleida 029_22 검출 및 분리
RT-qPCR을 사용하여 다양한 조직에서 바이러스 부하를 측정했습니다(그림 4F). IM 그룹에서 바이러스 부하는 조직 전반에 걸쳐 비교적 일관적이었으며, 폐, 종격동 림프절 및 비장에서 가장 높은 부하를 보였습니다. IN 그룹에서 바이러스 부하는 조직에 따라 유의하게 달랐으며, 편도선 및 종격동 림프절에서 가장 높은 부하를 보였습니다. 예상대로, IN 그룹의 전반적인 바이러스 부하는 IM 그룹보다 낮았으며, 이는 부검 시점의 차이와 관련이 있을 수 있습니다. IN 그룹에서 감염된 동물의 조직 부하의 유의한 변동성은 또한 서로 다른 사망 시점과 관련이 있었습니다(12, 21, 43 dpi vs. 63 dpi에서 회색으로 표시된 샘플). 대조군의 어떤 조직 샘플에서도 바이러스 RNA가 검출되지 않았습니다.
표 1. 감염 후 12, 21, 43일에 사망한 동물에서 수집한 조직은 aVI에 대해 양성 반응을 보였습니다.
(표 참고: 표 1은 조직 샘플의 RT-qPCR 및 바이러스 분리 결과를 요약합니다. "MLN"은 종격동 림프절을 나타내고, "ILN"은 서혜부 림프절을 나타냅니다.)
9. PRRSV 감염 조직의 병리학적 및 면역조직화학적 분석
부검 소견: PRRSV 감염 후 사망한 동물(특히 감염 후 12~21일에 사망한 동물)은 자색 반점 피부, 전신 부종, 심한 림프절병증, 비장 비대(때로는 여포 과형성 동반) 및 위 출혈을 포함한 유의한 전신 병변을 보였습니다. 폐 병변이 두드러졌으며, 부분적 허탈, 다발성 경화 및 적갈색 반점을 나타내어 간질성 폐렴과 일치했으며, 조기에 사망한 동물에서 더 심한 병변이 나타났습니다(그림 8A). 비강 내 감염된 동물의 약 20%는 이차 세균 감염으로 인한 농양, 심낭염 및 관절염도 발생했습니다. 대조군에서는 육안 병변이 관찰되지 않았습니다.
그림 8. 조직병리학적 분석 결과, IM 및 IN 그룹에서 조기에 사망한 동물(12-21 dpi)의 간질성 폐렴 점수는 1.83~3.33점이었습니다. 그러나 이러한 점수는 63 dpi에 희생된 동물에서 유의하게 감소했습니다(대조군, 0.17-0.83점; IN 그룹, 0.50-1.17점). 특히, IN 그룹의 편도선 조직학적 점수는 63 dpi에서 대조군보다 유의하게 높았지만(p<0.05), 다른 조직에서는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다(그림 8C).
(캡션: 그림 8B는 조직병리학적 점수를 보여주고, 그림 8C는 63 dpi에서 다양한 그룹의 조직학적 점수를 비교합니다)
현미경 병리학은 모든 감염된 동물의 폐에서 간질성 폐렴(폐포벽 비후, 세포 증식 및 염증 세포 침윤)을 나타냈습니다. 삼출물과 괴사 조직이 폐포 내에 존재했으며, 혈관 손상의 징후가 나타났습니다. 림프 조직(림프절 및 비장)은 심한 림프구 감소증과 괴사를 보였으며, 혈관 손상(예: 혈전증 및 혈관염)이 동반되었습니다. 뇌 백질에서 혈관 주위 염증 세포 침윤, 부종 및 신경교증이 관찰되었습니다(그림 9A).
면역조직화학(IHC) 분석은 감염된 동물의 폐, 림프절, 편도선 및 비장에서 대식세포에서 PRRSV 항원을 검출했으며, 때로는 II형 폐포 세포에서도 검출했습니다(그림 9B). 바이러스 항원은 뇌의 혈관 주위 염증 세포에서도 검출되었습니다.
그림 9. PRRSV 감염은 폐, 림프 조직 및 뇌에서 광범위한 병리학적 손상을 유발하며, 주로 대식세포 내에 국한되어 전신 병리학적 특징을 나타냅니다.
고찰
PRRSV는 단핵구 세포주에 제한적인 친화성을 가지며, 전통적으로 폐포 대식세포(PAM) 및 MARC-145 세포를 사용하여 분리 및 배양되었습니다. 그러나 PAM은 얻기 어렵고 배치 간 변동성이 크며, 고병원성 균주는 MARC-145에 적응하기 어렵습니다. 본 연구에서는 PAM 대신 특정 현장 균주에 민감한 불멸화된 세포주 PAM-KNU를 사용했습니다. Lleida 029_22 균주를 성공적으로 분리했으며, 그 성장 곡선은 PAM에서 관찰된 것과 유사했습니다. 현재 모든 PRRSV 균주에 적합한 보편적인 세포주는 없으며, 다양한 균주의 분리를 위해 더 적합한 세포주를 식별하기 위한 노력이 필요합니다.
결론
본 연구는 고병원성 PRRSV-1 균주를 이용한 비강 내 감염 모델을 성공적으로 확립했습니다. 임상 증상(높은 사망률, 심각한 증상, 지속적인 고열 및 바이러스혈증)은 현장 발생에서 관찰된 것과 매우 유사합니다. 주요 발견은 감염 경로가 결과에 유의하게 영향을 미쳤다는 것입니다. 근육 내(IM) 감염은 100% 급성 사망률을 초래한 반면, 비강 내(IN) 감염은 사망률이 30%에 불과했으며, 감염된 돼지는 결국 완전히 회복되었습니다. 이러한 유의한 차이는 농장 내 IM 주사 관행이 병원 내 전파를 통해 유행의 심각성을 유의하게 악화시킬 수 있는 위험성을 강조합니다.
담당자: Mr. Huang Jingtai
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