豚繁殖・呼吸障害症候群（PRRS）は、世界の養豚業に影響を与える最も重要な感染症の一つです。最近、スペイン北東部で高病原性PRRSV-1株が新たに発生（2020年に初めて検出）し、疾病管理に新たな課題が提示されています。これらの強毒株は現場で壊滅的な被害をもたらしますが、その包括的な実験的特性評価はまだ十分に調査されていません。そこで、本研究では、新たに発生した高病原性スペインPRRSV-1株Lleida 029_22の遺伝的起源、in vitroでの複製特性、病原性メカニズムを、感染経路（筋肉内および鼻腔内）の二重経路を通じて体系的に調査しました。
Wiley Online Libraryに掲載された最近の研究では、高病原性PRRSV-1株Lleida 029_22の豚における遺伝的特性と病原性が分析されました。系統解析の結果、Lleida 029_22株はPRRSV-1 Rosaliaアウトブレイクに関連する新しいクレードに属し、高病原性イタリア株PR40と相同であることが明らかになりました。この株は、in vitroで豚肺胞マクロファージおよびPAM-KNU細胞で効率的に複製しますが、MARC-145細胞では複製しません。
その病原性を評価するために、8週齢の子豚にLleida 029_22を2×10⁵ TCID⁵⁰の同じ用量で筋肉内（IM）および鼻腔内（IN）注射で接種しました。IM接種では、14日以内に100％の死亡率となり、高ウイルス血症、高ウイルス排出、炎症性サイトカイン（特にIL-6）の有意な上昇、および重度の肺病変を伴いました。対照的に、INワクチンを接種した豚は、死亡率が低く（30％）、臨床症状も軽度でした。生存者は63日後に回復しましたが、28日以降、持続的なウイルス血症と排出、および低レベルの炎症性サイトカインと中和抗体を示しました。
興味深いことに、IN感染は、スペインの農場で高病原性Rosalia株によって引き起こされたアウトブレイクの臨床症状を忠実に再現しましたが、IM感染は院内感染のリスクを浮き彫りにしました。
背景：豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（PRRSV）は、世界の養豚業を脅かす主要な病原体です。その高い多様性と多様性により、既存のワクチンは一貫して効果的ではありません。2020年、スペインで「Rosalia」という高病原性PRRSV-1株が出現し、急速に広がり、深刻な損失（例えば、生育期の死亡率の増加）を引き起こしました。遺伝子解析によると、これは、組換えを通じて高病原性イタリア株PR40から発生した可能性が高いことが示唆されています。この株は、現場で高い流産率と死亡率（>20％）を引き起こしますが、体系的な実験データは不足しています。
研究目的と方法：本研究は、in vitroおよびin vivo実験を用いて、Rosaliaアウトブレイクから分離された高病原性PRRSV-1株を包括的に特徴付けることを目的としました。8週齢の子豚に、筋肉内（IM）および鼻腔内（IN）の感染経路で接種しました（IMは一般的に使用される実験経路であり、INは自然感染をシミュレートします）。
試験目的：臨床症状と死亡率の詳細な記録、死亡/剖検された豚の肉眼的、顕微鏡的、免疫組織化学的病理学的検査、ウイルス力学と伝播性を理解するための血清、唾液、鼻腔スワブ、直腸スワブ、および組織中のウイルス量、および免疫応答は、PRRSV特異的抗体および中和抗体レベル、ならびに血清サイトカインレベルを分析することによって評価されました。
重要な意義：本研究は、既存のワクチンの有効性を評価し、新しいワクチンを開発し、この高病原性株の病原性をさらに理解するための重要な実験モデルとデータ基盤を提供します。
結果
1. PRRSV-1株の系統解析とNsp2アミノ酸配列の特徴
ゲノム特性と系統的位置：
ディープシーケンシング（286×）により、PRRSV-1 Lleida 029_22株ゲノムが14,858 nt長であることが確認され（図1A）、系統的にPRRSV-1サブタイプ1系統に属しています。この株は、他の3つのRosaliaアウトブレイク関連株とは独立したクレードを形成し（図1A）、96.61％〜97.26％のヌクレオチド同一性を共有し、高病原性PR40株と相同です。
Nsp2欠失の特徴：
Lleida 029_22株のNsp2タンパク質は、63アミノ酸の欠失（Lelystad株に対する位置317-379）を示します（図1B）。この欠失はRosaliaクレード内で保存されており、その相同株であるPR40の欠失はさらに大きいため（図1A）、この遺伝的変異はクレードの進化の初期に発生したことが示唆されます。
図1. PRRSV-1 Lleida 029_22株の系統樹とNsp2配列アライメント
(A) 全ゲノム配列に基づいて構築された最大尤度系統樹（GTRモデル、1000ブートストラップテスト）。
△：本研究で使用したLleida 029_22株；〇：Rosaliaアウトブレイク関連株。
(B) 部分Nsp2アミノ酸配列アライメント（CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1）。
比較株：Lleida 029_22、Rosaliaアウトブレイク関連株、高病原性PR40株、およびプロトタイプLelystad株。
*注：Nsp2、非構造タンパク質2；PRRSV-1、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス1型。
2. PRRSV-1 Lleida 029_22株のin vitro複製特性
まず、Lleida 029_22株の複製特性をin vitroで評価しました。この株は、PAMおよびPAM-KNU細胞で効率的に複製しましたが、MARC-145細胞では複製しませんでした（図2A）。3種類の細胞におけるウイルス増殖曲線は、PAMおよびPAM-KNU細胞で同様のウイルス力価を示しましたが、後者の方がわずかに低い力価でした（図2B）。72時間後、両方の細胞型は、約10⁵ TCID⁵⁰/mLのウイルス力価に達しました。対照的に、MARC-145細胞は効率的なウイルス感染を維持することができず、72時間後にはウイルス力価が検出不能レベルに低下しました。
図2. 3つの細胞株におけるPRRSV-1 Lleida 029_22の増殖動態
(A) 感染後72時間の蛍光顕微鏡写真（MOI = 0.1、抗Nタンパク質抗体染色；20倍対物レンズ）
(B) PAM-KNU細胞におけるウイルス力価の動態（3つの独立した実験の平均±SD）
*注：MOI、感染多重度；PAM、一次肺胞マクロファージ；PRRSV-1、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス1型。
3. Lleida 029_22に感染した豚の臨床症状と死亡率
PRRSV-1 Lleida 029_22の病原性は、筋肉内（IM）および鼻腔内（IN）接種経路によって評価されました。IM群の豚は、1 dpiから体温の上昇を示し、7 dpiで41℃を超え、13 dpiまで持続しました。鼻腔内接種群は、軽度の発熱を示し、接種後5日目にわずかに41℃を超えただけで、その後間欠的な発熱パターンを示しました。対照群は、実験全体を通して異常な体温を示しませんでした（図3A）。
臨床観察の結果、IM感染群は急性呼吸窮迫、神経症状、重度の呼吸困難、および耳と陰嚢のチアノーゼを経験しましたが、IN感染群は主に中等度で持続的な呼吸困難を示しました。その他の臨床症状には、毛並みの粗さ、浮腫（四肢と首に最も顕著）、関節炎、および両群の全身状態の悪化が含まれていましたが、これらはIM群でより重度でした。これらの重度の臨床症状は、主に接種後12〜14日に集中し、高死亡率または福祉上の理由による安楽死の時期と一致しました。
全体として、IM感染群の臨床スコアは、接種後11、12、および14日目にIN感染群よりも有意に高かった（p <0.05）であり、接種後14日目にピークに達しました（図3B）。IN群の臨床スコアは低く、感染後13日目にピークに達しました（dpi）。その後、症状は徐々に軽減しましたが、スコアは対照群よりも有意に高いままでした（p <0.05）。実験全体を通して、対照群では臨床症状は観察されませんでした（図3B）。線形混合モデル分析（異なる時点での同じ動物からの観測の非独立性を考慮）により、群および日特異的変数が最初の14日間の体温と臨床スコアに有意に影響することが明らかになりました（p <0.05）。IM群とIN群の間、および両方の感染群と対照群の間で有意差が認められました。生存分析の結果、IM感染群のすべての動物は感染後14日以内に死亡し、100％の死亡率を示しました。自然死または誘発死は、感染後12〜14日に集中しました。IN感染群では、感染後63日までに死亡率は30％であり、死亡は感染後12、21、および43日に発生しました。対照群のすべての動物は、実験の最後まで生存しました（図3C）。
図3. PRRSV-1 Lleida 029_22に感染した豚の臨床転帰(A) 感染後の毎日の直腸温度（赤破線：発熱閾値>41℃；平均±SD）
(B) 毎日の平均臨床スコア（平均±SD；同じ文字は群間の有意差がないことを示します、p <0.05）
(C) 実験群の生存曲線
注：C、対照群；IM、筋肉内群；IN、鼻腔内群。
4. PRRSV感染動物におけるウイルス血症とウイルス排出PRRSV-1 Lleida 029_22感染後のウイルス血症レベルは、RT-qPCRによって評価されました。PRRSV RNAは、感染したすべての動物の血清で感染後3日目に検出され、対照群と比較してIM群とIN群の間で有意差が認められました（p <0.05；図4A）。IN群のウイルス血症は感染後7日目にピークに達し、IM群のウイルス量は、7日目と14日目の両方でIN群と対照群よりも有意に高かった（p <0.05）。その後、IN群のウイルス量は徐々に減少しましたが、28 dpiでも対照群よりも有意に高かった。
図4. ウイルス排出は、唾液および鼻腔/直腸スワブによって評価されました。感染したすべての動物は、唾液、鼻腔、および直腸スワブで3 dpiにウイルス陽性でした。
唾液排出は、IM群では14 dpiまで、IN群では実験の最後まで継続しました（3 dpiでピーク；図4B）。
鼻腔排出は、両群で7 dpiにピークに達し、IM群では7/14 dpiでIN群よりも有意に高いウイルス量を示しました（*p <0.05；図4C）。
直腸排出は、IM群では14 dpiまで、IN群では35 dpiまで継続し（56 dpiでわずかなリバウンドあり）、両方とも7 dpiでピークに達しました（図4D）。AUC分析により、感染群からのすべてのサンプルにおけるウイルス量が対照群よりも有意に高く、IM群の鼻腔スワブ量がIN群よりも高いことが確認されました（*p <0.05）。要約すると、PRRSV排出は早期に発生し、感染後も持続します。5. RT-qPCR陽性サンプルからの感染性PRRSVの分離の検証
RT-qPCR陽性サンプルに感染性ウイルスが存在することを確認するために、PAM-KNU細胞を用いてウイルス分離（VI）実験を実施しました（図5）。血清サンプルについては、ウイルス分離の成功率は、IM群では接種後3〜14日（dpi）に採取されたサンプルで100％（10/10）、IN群では接種後3〜7日（dpi）に採取されたサンプルで100％（10/10）でした。しかし、成功率は、接種後14日目（70％）、接種後21日目（55.6％）、および接種後28日目（12.5％）で徐々に減少しました。
図5. 3つの感染性ウイルス株が、2回の培養継代後、感染後3日（dpi）に両方の感染動物から採取された唾液サンプルから正常に分離されました。鼻腔または直腸スワブからは感染性ウイルスは分離されませんでした。
6. PRRSV-1 Lleida 029_22感染によって誘導されるサイトカイン応答サイトカインレベルを評価するために、最初の14日間に血清サンプルを採取し、3つの群の間で有意差が明らかになりました（図6）。IFN-αレベルは、感染後3、7、および14日目（dpi）に両方の感染群で有意に上昇し、IM群のIFN-αレベルは、感染後14日目にIN群よりも有意に高かった（p <0.05）。炎症性サイトカインIL-1α、IL-12、およびIL-6は同様の傾向を示しました。IL-1αは、感染後3日目にIN群で増加し、安定したままでしたが、IM群のIL-6レベルは、感染後7日目と14日目に、対照群よりも有意に高かった（図6B、D-E）。特に注目すべきは、IL-6レベルが、感染後14日目にIM群でIN群よりも有意に高かったことです（p <0.05）。両群の感染動物のIL-1βは増加傾向を示し、IM群は3、7、および14 dpiで対照群よりも有意に高いレベルを示し、IN群は14 dpiでのみ有意差を示しました（図6C）。
図6. IL-12レベルは、14 dpiでIM群でIN群および対照群よりも有意に高かった（図6F）。全体的な傾向は、IM群でより強い炎症性サイトカイン応答を示し、特に7および14 dpiのIL-6レベルで、IM群の100％死亡率と正の相関がありました。
7. PRRSV-1 Lleida 029_22に感染した動物における特異的および中和抗体応答PRRSV-1およびPRRSV-2特異的抗体は、市販のELISAキットを用いて評価されました（図7A）。血清転換は、IM群の動物の70％、IN群の動物の90％で14 dpiに発生しました。両群のS/P比は、対照群よりも有意に高かった（p <0.05）。IN群の抗体レベルは21 dpiに低下し始め、42 dpiで安定し、56 dpiにリバウンドし、その後63 dpiにわずかに低下しました。対照群は、実験全体を通して血清陰性のままでした（S/P <0.4）。
図7. 中和抗体試験の結果、IN群では、28 dpiでわずか2 log₂の低力価が検出され、その後56 dpiで3.71 log₂に徐々に増加しました（図7B）。抗体価は、同じ時点の個体間で異なり、中和抗体の出現は、28 dpi以降の血清からの感染性ウイルスのクリアランスと一致しました（図4B）。対照群では中和抗体は検出されませんでした。
8. PRRSV-1 Lleida 029_22の組織ホモジネートにおける検出と分離
RT-qPCRを用いて、さまざまな組織中のウイルス量を測定しました（図4F）。IM群では、ウイルス量は組織間で比較的一貫しており、肺、縦隔リンパ節、および脾臓で最も高い量を示しました。IN群では、ウイルス量は組織間で有意に異なり、扁桃腺と縦隔リンパ節で最も高い量を示しました。予想通り、IN群の全体的なウイルス量はIM群よりも低く、これは剖検時間の違いに関連している可能性があります。IN群の感染動物における組織量の有意な変動は、死亡時間の違い（12、21、および43 dpiと63 dpiの灰色のサンプル）とも関連していました。対照群のどの組織サンプルからもウイルスRNAは検出されませんでした。
表1. 感染後12、21、または43日に死亡した動物から採取された組織は、aVI陽性でした。
（表注：表1は、組織サンプルからのRT-qPCRとウイルス分離の結果をまとめたものです。「MLN」は縦隔リンパ節を示し、「ILN」は鼠径リンパ節を示します。）9. PRRSV感染組織の病理学的および免疫組織化学的分析剖検所見：PRRSV感染後に死亡した動物（特に感染後12〜21日に死亡した動物）は、紫斑性皮膚、全身性浮腫、重度のリンパ節腫脹、脾腫（時には濾胞過形成を伴う）、および胃出血を含む有意な全身性病変を示しました。肺病変は顕著であり、部分的な虚脱、多巣性凝集、および赤褐色の斑点を呈し、間質性肺炎と一致し、早期に死亡した動物ではより重度の病変が見られました（図8A）。鼻腔内感染の約20％の動物は、二次的な細菌感染によって引き起こされる膿瘍、心膜炎、および関節炎も発症しました。対照動物では肉眼的病変は観察されませんでした。
図8. 病理組織学的分析の結果、IM群およびIN群で早期に死亡した動物（12〜21 dpi）の間質性肺炎スコアは1.83〜3.33ポイントでした。しかし、これらのスコアは、63 dpiで犠牲になった動物では有意に減少しました（対照群、0.17〜0.83ポイント；IN群、0.50〜1.17ポイント）。特に注目すべきは、IN群の扁桃腺組織学的スコアが、63 dpiで対照群よりも有意に高かったこと（p <0.05）ですが、他の組織では有意差は観察されませんでした（図8C）。
（キャプション：図8Bは病理組織学的スコアを示し、図8Cは63 dpiにおけるさまざまな群の組織学的スコアを比較しています）
顕微鏡的病理は、すべての感染動物の肺において間質性肺炎（肺胞壁の肥厚、細胞増殖、および炎症細胞浸潤）を明らかにしました。滲出液と壊死組織が肺胞内に存在し、血管損傷の兆候を伴っていました。リンパ組織（リンパ節と脾臓）は、重度のリンパ球減少症と壊死を示し、血管損傷（例：血栓症と血管炎）を伴っていました。脳白質には、血管周囲の炎症細胞浸潤、浮腫、および神経膠症が観察されました（図9A）。免疫組織化学（IHC）分析により、感染動物の肺、リンパ節、扁桃腺、および脾臓のマクロファージ、および場合によってはII型肺胞上皮細胞においてPRRSV抗原が検出されました（図9B）。ウイルス抗原は、脳の血管周囲の炎症細胞でも検出されました。図9. PRRSV感染は、肺、リンパ組織、および脳に広範な病理学的損傷を引き起こし、主にマクロファージ内に局在し、全身性の病理学的特徴を示しています。
考察
PRRSVは単球系細胞株に対する限られた指向性を示し、伝統的に肺胞マクロファージ（PAM）およびMARC-145細胞を用いて分離および培養されてきました。しかし、PAMは入手が困難であり、バッチ間のばらつきが大きく、高病原性株はMARC-145に適応することが困難です。本研究では、PAMの代わりに、特定のフィールド株に感受性のある不死化細胞株PAM-KNUを使用しました。Lleida 029_22株を正常に分離し、その増殖曲線はPAMで観察されたものと同様でした。現在、すべてのPRRSV株に適した普遍的な細胞株はなく、多様な株の分離には、より適切な細胞株を特定するための今後の努力が必要です。
結論
本研究は、高病原性PRRSV-1株を用いた鼻腔内感染のモデルを正常に確立しました。臨床症状（高死亡率、重度の症状、持続的な高熱、およびウイルス血症）は、現場のアウトブレイクで観察されたものと非常によく似ています。重要な発見は、感染経路が結果に有意に影響したことです。筋肉内（IM）感染は100％の急性死亡をもたらしましたが、鼻腔内（IN）感染の死亡率はわずか30％であり、感染した豚は最終的に完全に回復しました。この有意な違いは、農場でのIM注射の実践が、院内感染を通じて流行の重症度を著しく悪化させる可能性があるリスクを浮き彫りにしています。
コンタクトパーソン: Mr. Huang Jingtai
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