Hội chứng sinh sản và hô hấp của lợn (PRRS) vẫn là một trong những bệnh truyền nhiễm quan trọng nhất ảnh hưởng đến ngành công nghiệp lợn toàn cầu.Sự xuất hiện gần đây của một chủng PRRSV-1 gây bệnh cao ở đông bắc Tây Ban Nha (được phát hiện lần đầu tiên vào năm 2020) đã tạo ra những thách thức mới cho việc kiểm soát bệnhMặc dù những chủng độc hại này là tàn phá trong lĩnh vực này, đặc điểm thử nghiệm toàn diện của chúng vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ.nghiên cứu này đã nghiên cứu một cách có hệ thống nguồn gốc di truyền, đặc điểm sao chép in vitro và cơ chế gây bệnh của chủng PRRSV-1 Tây Ban Nha gây bệnh cao mới xuất hiện, Lleida 029_22,qua hai con đường lây nhiễm (trong cơ và trong mũi).
Một nghiên cứu gần đây được công bố trên Thư viện trực tuyến Wiley đã phân tích các đặc điểm di truyền và gây bệnh của chủng PRRSV-1 gây bệnh cao Lleida 029_22 ở lợn.Phylogenetic phân tích cho thấy Lleida 029_22 chủng thuộc về một clade mới liên quan đến PRRSV-1 Rosalia bùng phát và là đồng tính với cao gây bệnh gốc Ý PR40Loại này nhân rộng hiệu quả trong tế bào đại thực bào tủy của lợn và tế bào PAM-KNU in vitro, nhưng không ở các tế bào MARC-145.
Để đánh giá khả năng gây bệnh của nó, heo tám tuần tuổi đã được tiêm cùng một liều 2 × 105 TCID5 của Lleida 029_22 qua tiêm bắp (IM) và tiêm mũi (IN).Tiêm tiêm IM dẫn đến tỷ lệ tử vong 100% trong vòng 14 ngày, đi kèm với viremia cao, tiết dịch virus cao, mức độ tăng đáng kể của các cytokine proinflammatory (đặc biệt là IL-6) và tổn thương phổi nghiêm trọng.lợn được tiêm vắc-xin IN có tỷ lệ tử vong thấp hơn (30%) và các triệu chứng lâm sàng vừa phảiNhững người sống sót hồi phục sau 63 ngày, nhưng đã thể hiện viremia và chảy máu kéo dài, và mức độ thấp của các cytokine gây viêm và kháng thể trung hòa từ ngày 28 trở đi.
Điều thú vị là, IN infection đã lặp lại một cách trung thực các triệu chứng lâm sàng của một đợt bùng phát do chủng Rosalia rất độc hại trên các trang trại Tây Ban Nha,trong khi nhiễm trùng IM làm nổi bật nguy cơ lây truyền bệnh viện.
Bối cảnh: Virus hội chứng sinh sản và hô hấp của lợn (PRRSV) là một mầm bệnh chính đe dọa ngành công nghiệp lợn toàn cầu.Sự biến đổi và đa dạng cao của nó làm cho các loại vắc-xin hiện có không phù hợpVào năm 2020, một chủng PRRSV-1 rất độc hại có tên "Rosalia" xuất hiện ở Tây Ban Nha và lan rộng nhanh chóng, gây ra tổn thất nghiêm trọng (ví dụ, tăng tỷ lệ tử vong trong mùa phát triển).Phân tích di truyền cho thấy nó có thể xuất phát từ một chủng rất độc hại của Ý, PR40, thông qua tái kết hợp. chủng này gây ra tỷ lệ phá thai và tử vong cao (> 20%) trên thực địa, nhưng thiếu dữ liệu thử nghiệm có hệ thống.
Mục tiêu và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu này nhằm mục đích mô tả toàn diện chủng PRRSV-1 độc tính cao được phân lập từ dịch bệnh Rosalia bằng cách sử dụng các thí nghiệm in vitro và in vivo.Con heo tám tuần tuổi đã được tiêm qua cả hai đường truyền nhiễm nội cơ (IM) và nội mũi (IN) (IM là con đường thử nghiệm thường được sử dụng), trong khi IN mô phỏng nhiễm trùng tự nhiên).
Mục tiêu thử nghiệm: Tài liệu chi tiết về các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ tử vong; kiểm tra bệnh lý tổng thể, kính hiển vi và miễn dịch hóa học của lợn đã chết / xác chết; tải lượng virus trong huyết thanh,nước bọt, các mẫu đun mũi, mẫu đun trực tràng và các mô, cũng như cách ly virus, đã được thực hiện để hiểu động lực và khả năng lây nhiễm của virus;và đáp ứng miễn dịch được đánh giá bằng cách phân tích mức kháng thể trung hòa và cụ thể của PRRSV, cũng như nồng độ cytokine huyết thanh.
Tầm quan trọng chính: Nghiên cứu này sẽ cung cấp một mô hình thử nghiệm quan trọng và cơ sở dữ liệu để đánh giá hiệu quả của vắc-xin hiện có, phát triển vắc-xin mới,và hiểu rõ hơn về bệnh sinh của chủng rất độc hại này.
Kết quả
1. Phylogenetic Analysis of PRRSV-1 Strains and Nsp2 Amino Acid Sequence Characterization Phân tích phylogenetic của chủng PRRSV-1 và Nsp2 Amino acid sequence Characterization
Đặc điểm gen và vị trí phylogenetic:
Việc sắp xếp thứ tự sâu (286 ×) xác nhận rằng bộ gen chủng PRRSV-1 Lleida 029_22 dài 14.858 nt (Hình 1A), thuộc về phylogenetically dòng PRRSV-1 phân loại 1.Loại này tạo thành một clade độc lập từ ba chủng khác liên quan đến dịch bệnh Rosalia (Hình 1A), chia sẻ bản sắc nucleotide 96, 61% - 97, 26%, và đồng nhất với chủng PR40 gây bệnh cao.
Đặc điểm loại bỏ Nsp2:
Protein Nsp2 của chủng Lleida 029_22 cho thấy sự xóa 63 axit amin (vị trí 317-379 so với chủng Lelystad) (Hình 1B).trong khi việc xóa trong chủng đồng tính của nó, PR40, thậm chí còn lớn hơn (Hình 1A), cho thấy sự thay đổi di truyền này xuất hiện sớm trong quá trình tiến hóa của clade.
Hình 1. Cây phylogenetic của chủng PRRSV-1 Lleida 029_22 và sắp xếp trình tự Nsp2
(A) Cây phylogenetic có khả năng tối đa được xây dựng dựa trên toàn bộ trình tự gen (mô hình GTR, 1000 thử nghiệm khởi động).
▲: Lleida 029_22 chủng được sử dụng trong nghiên cứu này; ●: chủng liên quan đến dịch bệnh Rosalia.
(B) Phân phối chuỗi axit amin Nsp2 một phần (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).
Các chủng so sánh: Lleida 029_22, chủng liên quan đến dịch bệnh Rosalia, chủng PR40 độc tính cao và chủng nguyên mẫu Lelystad.
* Lưu ý: Nsp2, protein không cấu trúc 2; PRRSV-1, virus hội chứng sinh sản và hô hấp lợn loại 1.
2Các đặc điểm nhân tạo trong ống nghiệm của chủng PRRSV-1 Lleida 029_22
Đầu tiên, các đặc điểm sao chép của chủng Lleida 029_22 đã được đánh giá in vitro. chủng này sao chép hiệu quả trong các tế bào PAM và PAM-KNU, nhưng không ở các tế bào MARC-145 (Hình 2A).Các đường cong tăng trưởng virus trong ba loại tế bào cho thấy các tiêu đề virus tương tự trong các tế bào PAM và PAM-KNU, mặc dù sau này có tiêu đề thấp hơn một chút (Hình 2B). Sau 72 giờ, cả hai loại tế bào đạt tiêu đề virus khoảng 105TCID50/ml.Các tế bào MARC-145 không thể duy trì nhiễm virus hiệu quả, với tiêu đề virus giảm xuống mức không thể phát hiện được sau 72 giờ.
Hình 2. Động học tăng trưởng của PRRSV-1 Lleida 029_22 trong ba dòng tế bào
(A) Viên hiển vi quang quang 72 giờ sau khi nhiễm trùng (MOI = 0.1, nhuộm màu với kháng thể protein chống N; mục tiêu 20x)
(B) Động lực của tiêu chuẩn virus trong tế bào PAM-KNU (trung bình ± SD của ba thí nghiệm độc lập)
* Lưu ý: MOI, tỷ lệ nhiễm trùng; PAM, đại thực bào tủy nguyên phát; PRRSV-1, virus hội chứng sinh sản và hô hấp lợn loại 1.
3Các biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ tử vong ở lợn bị nhiễm Lleida 029_22
Khả năng gây bệnh của PRRSV-1 Lleida 029_22 đã được đánh giá bằng cách tiêm bằng đường bắp (IM) và mũi (IN).vượt quá 41 °C ở 7 dpiNhóm tiêm chủng bằng mũi có sốt nhẹ hơn, chỉ vượt quá 41 °C trong thời gian ngắn vào 5 ngày sau tiêm chủng, sau đó là một mô hình sốt gián đoạn.Nhóm kiểm soát không thể hiện nhiệt độ cơ thể bất thường trong suốt thí nghiệm (Hình 3A).
Các quan sát lâm sàng cho thấy nhóm bị nhiễm IM có chứng khó thở cấp tính, triệu chứng thần kinh, khó thở nghiêm trọng, và chứng ạch dương của tai và bì,Trong khi nhóm bị nhiễm IN chủ yếu cóCác dấu hiệu lâm sàng bổ sung bao gồm lông lông, phù (còn rõ rệt nhất ở chân tay và cổ), viêm khớp và tình trạng cơ thể tổng thể xấu đi ở cả hai nhóm.nhưng chúng nghiêm trọng hơn trong nhóm IMNhững biểu hiện lâm sàng nghiêm trọng này chủ yếu tập trung giữa 12 và 14 ngày sau khi tiêm chủng, trùng với thời kỳ tử vong cao hoặc tử vong vì lý do phúc lợi.
Nhìn chung, điểm lâm sàng trong nhóm nhiễm IM cao hơn đáng kể so với nhóm nhiễm IN ở 11, 12 và 14 ngày sau tiêm chủng (p < 0, 05),đạt đỉnh 14 ngày sau khi tiêm chủng (Hình 3B)Điểm số lâm sàng trong nhóm IN thấp hơn, đạt đỉnh cao sau 13 ngày nhiễm trùng (dpi).nhưng điểm số vẫn cao hơn đáng kể so với nhóm kiểm soát (p < 0Không có triệu chứng lâm sàng nào được quan sát thấy trong nhóm kiểm soát trong suốt thí nghiệm (Hình 3B).
Linear mixed model analysis (accounting for the non-independence of observations from the same animal at different time points) revealed that group- and day-specific variables significantly influenced body temperature and clinical scores during the first 14 days (p < 0.05). Các khác biệt đáng kể được tìm thấy giữa các nhóm IM và IN, cũng như giữa cả hai nhóm nhiễm trùng và nhóm kiểm soát.
Phân tích sinh tồn cho thấy tất cả động vật trong nhóm nhiễm trùng IM đã chết trước 14 ngày sau khi nhiễm trùng, với tỷ lệ tử vong 100%.Các trường hợp tử vong tự nhiên hoặc gây ra tập trung giữa 12 và 14 ngày sau khi nhiễmTrong nhóm nhiễm trùng IN, tỷ lệ tử vong là 30% vào 63 ngày sau khi nhiễm trùng, với các trường hợp tử vong xảy ra vào 12, 21 và 43 ngày sau khi nhiễm trùng.Tất cả động vật trong nhóm đối chứng sống sót cho đến khi kết thúc thí nghiệm (Hình 3C).
Hình 3. Kết quả lâm sàng ở lợn bị nhiễm PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) Nhiệt độ trực tràng hàng ngày sau khi nhiễm trùng (đường chấm đỏ: ngưỡng sốt > 41 °C; trung bình ± SD)
(B) Điểm lâm sàng trung bình hàng ngày (Tức ± SD; Các chữ cái giống nhau không cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm, p < 0,05)
(C) Đường cong sinh tồn cho các nhóm thí nghiệm
Lưu ý: C, nhóm đối chứng; IM, nhóm nội cơ; IN, nhóm nội mũi.
4Viremia và Viral Shedding ở động vật bị nhiễm PRRSV
Nồng độ viremia sau nhiễm PRRSV-1 Lleida 029_22 đã được đánh giá bằng RT-qPCR.với sự khác biệt đáng kể giữa nhóm IM và IN so với nhóm đối chứng, vẫn âm (p < 0.05; Hình 4A). viremia trong nhóm IN đạt đỉnh sau 7 ngày nhiễm trùng,Trong khi đó, lượng virus trong nhóm IM cao hơn đáng kể so với nhóm IN và nhóm kiểm soát ở cả 7 và 14 ngày sau khi nhiễm trùng (p < 0).Sau đó, tải virus trong nhóm IN giảm dần, nhưng vẫn cao hơn đáng kể so với nhóm kiểm soát ở mức 28 dpi.
Hình 4. Sự rác thải virus được đánh giá bằng nước bọt và ống lọc mũi / trực tràng. Tất cả động vật bị nhiễm đều xét nghiệm dương tính với virus ở mức 3 dpi trong nước bọt, mũi và ống lọc trực tràng.
Sự chảy nước bọt tiếp tục cho đến 14 dpi trong nhóm IM và cho đến khi kết thúc thí nghiệm trong nhóm IN (đỉnh ở 3 dpi; Hình 4B).
Sự chảy mũi đạt đỉnh ở mức 7 dpi ở cả hai nhóm, với tải virus cao hơn đáng kể trong nhóm IM ở mức 7/14 dpi so với nhóm IN (* p < 0.05; Hình 4C).
Việc rác thải trực tràng tiếp tục cho đến 14 dpi trong nhóm IM và đến 35 dpi trong nhóm IN (với sự phục hồi nhẹ ở 56 dpi), với cả hai đỉnh ở 7 dpi (Hình 4D).
Phân tích AUC xác nhận rằng tải lượng virus trong tất cả các mẫu từ các nhóm bị nhiễm bệnh cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng,và rằng khối lượng swab mũi trong nhóm IM cao hơn so với nhóm IN (*p<0.05). Tóm lại, việc thải PRRSV xảy ra sớm và được duy trì sau khi nhiễm trùng.
5Kiểm tra cách ly PRRSV truyền nhiễm từ các mẫu RT-qPCR dương tính
Để xác nhận sự hiện diện của virus truyền nhiễm trong các mẫu RT-qPCR dương tính, các thí nghiệm cách ly virus (VI) được thực hiện bằng cách sử dụng các tế bào PAM-KNU (Hình 5). the success rate of virus isolation was 100% (10/10) for samples collected between 3 and 14 days post-inoculation (dpi) in the IM group and 100% (10/10) for samples collected between 3 and 7 days post-inoculation (dpi) in the IN groupTuy nhiên, tỷ lệ thành công giảm dần sau 14 ngày tiêm chủng (70%), 21 ngày tiêm chủng (55,6%) và 28 ngày tiêm chủng (12,5%).
Hình 5. Ba chủng virus truyền nhiễm đã được cách ly thành công từ các mẫu nước bọt được thu thập từ cả hai động vật bị nhiễm bệnh sau 3 ngày sau khi nhiễm trùng (dpi) sau hai đoạn văn hóa.Không có virus truyền nhiễm được phân lập từ ống lọc mũi hoặc trực tràng.
6Phản ứng cytokine do nhiễm PRRSV-1 Lleida 029_22
Các mẫu huyết thanh đã được thu thập trong 14 ngày đầu sau nhiễm trùng để đánh giá mức cytokine, tiết lộ sự khác biệt đáng kể giữa ba nhóm (Hình 6).Nồng độ IFN-α tăng đáng kể ở cả hai nhóm nhiễm trùng, 7, và 14 ngày sau nhiễm trùng (dpi), với mức IFN-α trong nhóm IM cao hơn đáng kể so với nhóm IN ở 14 ngày sau nhiễm trùng (p< 0, 05).và IL-6 cho thấy xu hướng tương tự: IL-1α tăng trong nhóm IN 3 ngày sau khi nhiễm trùng và vẫn ổn định,trong khi mức IL-6 trong nhóm IM cao hơn đáng kể so với nhóm kiểm soát ở ngày 7 và 14 sau khi nhiễm trùng (Hình 6B).Đặc biệt cần lưu ý, mức độ IL-6 cao hơn đáng kể trong nhóm IM so với nhóm IN ở 14 ngày sau nhiễm trùng (p<0. 05).IL-1β ở cả hai nhóm động vật bị nhiễm bệnh cho thấy xu hướng gia tăng, với nhóm IM cho thấy mức cao hơn đáng kể so với nhóm kiểm soát ở mức 3, 7 và 14 dpi, trong khi nhóm IN chỉ cho thấy sự khác biệt đáng kể ở mức 14 dpi (Hình 6C).
Hình 6. Mức IL-12 cao hơn đáng kể trong nhóm IM so với nhóm IN và nhóm kiểm soát ở mức 14 dpi (Hình 6F).Xu hướng tổng thể cho thấy phản ứng cytokine chống viêm mạnh hơn trong nhóm IM, đặc biệt là ở mức IL-6 ở 7 và 14 dpi, tương quan tích cực với tỷ lệ tử vong 100% trong nhóm IM.
7Phản ứng kháng thể cụ thể và trung hòa ở động vật bị nhiễm PRRSV-1 Lleida 029_22
Các kháng thể cụ thể của PRRSV-1 và PRRSV-2 đã được đánh giá bằng các bộ ELISA thương mại (Hình 7A).Seroconversion xảy ra ở 70% động vật trong nhóm IM và ở 90% động vật trong nhóm IN ở 14 dpiTỷ lệ S / P ở cả hai nhóm cao hơn đáng kể so với nhóm kiểm soát (p < 0,05).Nhảy lại ở 56 dpi, và sau đó giảm nhẹ ở 63 dpi Nhóm kiểm soát vẫn giữ seronegative trong suốt thí nghiệm (S / P < 0, 4).
Hình 7. Xét nghiệm kháng thể trung hòa cho thấy trong nhóm IN, chỉ có một tiêu đề thấp 2 log2 được phát hiện ở 28 dpi, sau đó tăng dần lên 3,71 log2 ở 56 dpi (Hình 7B).Tiêu chuẩn kháng thể khác nhau giữa các cá nhân tại cùng một thời điểm, và sự xuất hiện của các kháng thể trung hòa trùng với việc loại bỏ virus nhiễm trùng từ huyết thanh sau 28 dpi (Hình 4B)..
8. Phát hiện và cô lập PRRSV-1 Lleida 029_22 trong mô đồng bào
RT-qPCR được sử dụng để đo tải virus trong các mô khác nhau (Hình 4F).các hạch bạch huyết trung thắtTrong nhóm IN, tải lượng virus khác nhau đáng kể trên các mô, với tải lượng cao nhất ở amygdala và hạch bạch huyết trung tâm.tổng tải virus trong nhóm IN thấp hơn nhóm IM, có thể liên quan đến thời gian xác tử khác nhau.Sự biến đổi đáng kể trong tải trọng mô ở động vật bị nhiễm trong nhóm IN cũng liên quan đến thời gian chết khác nhau (bộ mẫu bị xám ở 12 tuổi).Không có RNA virus nào được phát hiện trong bất kỳ mẫu mô nào từ nhóm kiểm soát.
Bảng 1. Các mô thu thập từ động vật chết ở 12, 21 hoặc 43 ngày sau khi nhiễm trùng được xét nghiệm dương tính với aVI.
(Ghi chú bảng: Bảng 1 tóm tắt kết quả của RT-qPCR và cách ly virus từ các mẫu mô. "MLN" biểu thị các hạch bạch huyết trung thâm, và "ILN" biểu thị các hạch bạch huyết dưới nách.)
9Phân tích bệnh lý và miễn dịch hóa học của các mô bị nhiễm PRRSV
Kết quả khám nghiệm tử thi: Những con vật đã chết sau khi nhiễm PRRSV (đặc biệt là những con đã chết trong khoảng 12 đến 21 ngày sau khi nhiễm bệnh) cho thấy các tổn thương hệ thống đáng kể, bao gồm da tím,bẩm thạch chungCác tổn thương phổi là nổi bật, cho thấy sự sụp đổ một phần, củng cố đa tâm,Và những vết bẩn màu nâu đỏ, phù hợp với viêm phổi giữa, với các tổn thương nghiêm trọng hơn ở động vật chết sớm (Hình 8A).viêm tim mạchKhông có tổn thương lớn được quan sát thấy ở động vật đối chứng.
Hình 8. Phân tích bệnh lý học cho thấy rằng điểm số viêm phổi giữa ở động vật chết sớm (12-21 dpi) trong nhóm IM và IN dao động từ 1,83 đến 3,33 điểm.Các điểm này giảm đáng kể ở động vật bị giết ở 63 dpi (nhóm kiểm soát).Đặc biệt cần lưu ý, điểm histological của amygdala trong nhóm IN cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng ở 63 dpi (p< 0.05),nhưng không có sự khác biệt đáng kể được quan sát thấy ở các mô khác (Hình 8C).
(Tiêu đề: Hình 8B cho thấy các điểm histopathological, và Hình 8C so sánh các điểm histological của các nhóm khác nhau ở 63 dpi)
Bệnh lý học vi mô đã phát hiện viêm phổi giữa (sự dày lên của tường phổi, sự gia tăng tế bào và xâm nhập tế bào viêm) trong phổi của tất cả các động vật bị nhiễm bệnh.Chất thải và mô chết đã có mặt bên trong các tế bào tủyCác mô bạch huyết (hạch bạch huyết và lá lách) cho thấy bệnh lymphopenia và necrosis nghiêm trọng, đi kèm với tổn thương mạch máu (ví dụ, xơ máu và viêm mạch máu).Thâm nhập tế bào viêm xung quanh mạch máu, phù và gliosis được quan sát thấy trong chất trắng não (Hình 9A).
Phân tích miễn dịch hóa học (IHC) phát hiện ra kháng nguyên PRRSV trong đại thực bào, và đôi khi trong các tế bào phổi loại II, từ phổi, hạch bạch huyết, amygdala và lá lách của động vật bị nhiễm bệnh (Hình 9B).Các kháng nguyên virus cũng được phát hiện trong các tế bào viêm xung quanh ở não.
Hình 9. Nhiễm trùng PRRSV gây ra tổn thương bệnh lý rộng rãi ở phổi, mô bạch huyết và não, chủ yếu được định vị trong đại thực bào, thể hiện các đặc điểm bệnh lý toàn thân.
Cuộc thảo luận
PRRSV có một thái dương hạn chế cho các dòng tế bào đơn bào và theo truyền thống đã được cô lập và nuôi dưỡng bằng cách sử dụng các tế bào vĩ mô alveolar (PAMs) và tế bào MARC-145.PAM khó có được và có sự biến đổi lớn từ lô đến lôTrong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào PAM-KNU bất tử, nhạy cảm với một số chủng trường, thay vì PAM.Chúng tôi đã cô lập thành công chủng Lleida 029_22Hiện tại không có dòng tế bào phổ biến phù hợp với tất cả các chủng PRRSV,và nỗ lực trong tương lai là cần thiết để xác định các dòng tế bào phù hợp hơn để cô lập các chủng khác nhau.
Kết luận
Nghiên cứu này đã thành công trong việc thiết lập một mô hình nhiễm trùng nội mũi với một chủng PRRSV-1 rất độc hại.và viremia) rất giống với những người được quan sát trong các đợt bùng phát trên thực địaPhát hiện quan trọng là con đường nhiễm trùng ảnh hưởng đáng kể đến kết quả: nhiễm trùng nội cơ (IM) dẫn đến tỷ lệ tử vong cấp tính 100%.trong khi nhiễm trùng nội mũi (IN) chỉ có tỷ lệ tử vong 30%, và những con lợn bị nhiễm bệnh cuối cùng đã hồi phục hoàn toàn.Sự khác biệt đáng kể này làm nổi bật nguy cơ thực hành tiêm IM trong trang trại có thể làm trầm trọng hơn mức độ nghiêm trọng của dịch bệnh thông qua truyền bệnh viện..
Người liên hệ: Mr. Huang Jingtai
Tel: 17743230916
