новости компании о Вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней типа 1 обладает высокой вирулентностью у свиней

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (PRRS) остается одним из самых важных инфекционных заболеваний, поражающих мировую свиноводческую промышленность.Недавнее появление высокопатогенного штамма PRRSV-1 в северо-восточной Испании (впервые обнаруженный в 2020 году) создало новые проблемы для борьбы с болезнью.Хотя эти вирулентные штаммы являются разрушительными в полевых условиях, их всеобъемлющая экспериментальная характеристика еще не полностью изучена.Это исследование систематически исследовало генетическое происхождение, характеристики репликации in vitro и механизмы патогенности недавно появившегося высокопатогенного испанского штамма PRRSV-1, Lleida 029_22,через двойные пути заражения (внутримышечный и внутриназальный).

Недавнее исследование, опубликованное в Wiley Online Library, проанализировало генетические характеристики и патогенность высокопатогенного штамма PRRSV-1 Lleida 029_22 у свиней.Филогенетический анализ показал, что штамм Lleida 029_22 относится к новому кладу, связанному с вспышкой PRRSV-1 Rosalia, и является гомологичным высокопатогенному итальянскому штамму PR40Этот штамм эффективно размножается в альвеолярных макрофагах свиней и клетках PAM-KNU in vitro, но не в клетках MARC-145.

Для оценки патогенности, восьминедельные поросят были привиты той же дозой 2×105 TCID5 Lleida 029_22 через внутримышечные (IM) и внутриназальные (IN) инъекции.В результате инъекции внутривенной вакцины смертность достигла 100% в течение 14 дней., сопровождается высокой вирумией, высоким вирусом, значительно повышенным уровнем провоспалительных цитокинов (особенно IL-6) и тяжелыми лезиями легких.у свиней, вакцинированных вакциной IN, был более низкий уровень смертности (30%) и умеренные клинические признакиВыжившие выздоровели через 63 дня, но проявили длительную вирумию и выделение, а также низкий уровень провоспалительных цитокинов и нейтрализующих антитела с 28-го дня.

Интересно, что IN Infection верно резюмировал клинические симптомы вспышки, вызванной очень вирулентным штаммом Розалиа на испанских фермах,В то время как ИМ инфекция подчеркнула риск нозокомиальной передачи.

История: вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) является основным патогеном, угрожающим мировой свиноводческой промышленности.Его высокая изменчивость и разнообразие делают существующие вакцины неэффективными.В 2020 году в Испании появился очень вирулентный штамм PRRSV-1 под названием "Росалиа" и быстро распространился, что вызвало серьезные потери (например, увеличение смертности во время вегетационного сезона).Генетический анализ показывает, что он, вероятно, произошел от очень опасного итальянского штаммаЭтот штамм вызывает высокий уровень абортов и смертности (> 20%) в полевых условиях, но отсутствуют систематические экспериментальные данные.

Цели и методы исследования: целью данного исследования была всеобъемлющая характеристика высоковирусного штамма PRRSV-1, выделенного из вспышки Розалиа, с использованием экспериментов in vitro и in vivo.Восемьнедельные поросят были привиты как внутримышечным, так и внутриназальным путем инфекции (IM - обычно используемый экспериментальный путь)., в то время как IN имитирует естественную инфекцию).

Цели испытаний: подробная документация клинических признаков и смертности; грубое, микроскопическое и иммуногистохимическое патологическое исследование умерших/некропсированных свиней; вирусные нагрузки в сыворотке;слюнаДля изучения динамики вируса и его передаваемости были проведены выемки из носа, ректа и тканей, а также изоляция вируса.и иммунные реакции были оценены путем анализа уровней специфических для PRRSV и нейтрализующих антител., а также уровень цитокинов в сыворотке.

Ключевое значение: данное исследование предоставит ключевую экспериментальную модель и базу данных для оценки эффективности существующих вакцин, разработки новых вакцин,и дальнейшее понимание патогенеза этого очень вирулентного штамма.

Результаты

1Филогенетический анализ штаммов PRRSV-1 и характеристика последовательности аминокислот Nsp2

Геномические характеристики и филогенетическое расположение:

Глубокое секвенирование (286 раз) подтвердило, что геном штамма PRRSV-1 Lleida 029_22 имеет длину 14,858 нт (рисунок 1А), филогенетически принадлежащий линии PRRSV-1 подтипа 1.Этот штамм образует независимый клад от трех других штаммов, связанных с вспышкой Розалиа (рисунок 1А), разделяющий нуклеотидную идентичность 96, 61% - 97, 26%, и гомологичен высокопатогенному штамму PR40.

Характеристика удаления Nsp2:

В белке Nsp2 штамма Lleida 029_22 наблюдается делеция 63 аминокислот (позиции 317-379 по отношению к штамму Lelystad) (рисунок 1B).в то время как удаление в его гомологичный штамм, PR40, еще больше (рисунок 1A), что говорит о том, что эта генетическая вариация возникла на ранних этапах эволюции клада.

Рисунок 1. Филогенетическое дерево штамма PRRSV-1 Lleida 029_22 и выравнивание последовательности Nsp2
(А) Максимальная вероятность филогенетического дерева, построенного на основе всей последовательности генома (модель GTR, 1000 испытаний загрузки).

▲: штамм Lleida 029_22, использованный в данном исследовании; ●: штамм, связанный с вспышкой Розалиа.
(B) Частичное выравнивание последовательности аминокислот Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).

Сравненные штаммы: Lleida 029_22, штамм, связанный с вспышкой Розалиа, очень вирулентный штамм PR40 и прототип штамма Лелистада.
* Примечание: Nsp2, неструктурный белок 2; PRRSV-1, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней типа 1.

2Характеристики репликации PRRSV-1 Lleida 029_22 штамма in vitro

Во-первых, характеристики репликации штамма Lleida 029_22 были оценены in vitro. Этот штамм эффективно репликации в клетках PAM и PAM-KNU, но не в клетках MARC-145 (рисунок 2A).Кривые роста вируса в трех типах клеток показали аналогичные вирусные титры в клетках PAM и PAM-KNU.После 72 часов оба типа клеток достигли вирусных титров примерно 105TCID50/ml.Клетки MARC-145 не смогли поддерживать эффективную вирусную инфекциюВирусные титры снижаются до неотразимых уровней через 72 часа.

Рисунок 2. Кинетика роста PRRSV-1 Lleida 029_22 в трех клеточных линиях
(А) Флуоресцентная микроскопия через 72 часа после инфицирования (MOI = 0.1, окрашивание анти-Н белковым антителом; 20x цель)
(B) Динамика вирусных титров в клетках PAM-KNU (среднее значение ± SD трех независимых экспериментов)
* Примечание: МОИ, многократность инфекции; ПАМ, первичные альвеолярные макрофаги; PRRSV-1, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней 1 типа.

3Клинические проявления и смертность у свиней, инфицированных Ллейдой 029_22

Патогенность PRRSV-1 Lleida 029_22 оценивалась путем внутримышечной и внутринозальной инъекций.более 41°C при 7 dpiВ группе, получавшей интраназальную прививку, наблюдалась более мягкая лихорадка, которая только на короткое время превышала 41°C через 5 дней после прививки, за которой следовала периодическая лихорадка.В контрольной группе на протяжении всего эксперимента не наблюдалось аномальных температур тела (рисунок 3А)..

Клинические наблюдения показали, что группа инфицированных ИМ испытывала острые респираторные расстройства, неврологические симптомы, тяжелую дыхательную недостаточность и цианоз ушей и мошонки,В то время как в группе инфицированных IN в основном наблюдалось умеренноеДополнительные клинические признаки включали раздраженный мех, отеки (наиболее выраженные на конечностях и шее), воспаление суставов и общее ухудшение состояния тела в обеих группах.но они были более серьезными в группе IMЭти тяжелые клинические проявления были в основном сосредоточены в период между 12 и 14 днями после прививки, что совпадает с периодом высокой смертности или эвтаназии по соображениям благосостояния.

В целом, клинические показатели в группе, инфицированной ИМ, были значительно выше, чем в группе, инфицированной ИН, через 11, 12 и 14 дней после инъекции (p < 0, 05),пик через 14 дней после прививки (рисунок 3B)Клинические показатели в группе IN были ниже, достигнув своего пика через 13 дней после заражения (dpi).но показатели оставались значительно выше, чем в контрольной группе (p < 0)..05) Никаких клинических симптомов в контрольной группе не наблюдалось на протяжении всего эксперимента (рис. 3B).

Linear mixed model analysis (accounting for the non-independence of observations from the same animal at different time points) revealed that group- and day-specific variables significantly influenced body temperature and clinical scores during the first 14 days (p < 0Были обнаружены значительные различия между группами ИМ и ИН, а также между обеими группами инфекции и контрольной группой.

Анализ выживаемости показал, что все животные в группе инфекции IM умерли до 14 дней после инфицирования, с показателем смертности 100%.Естественные или вызванные смертью случаи сконцентрировались в период между 12 и 14 днями после инфицирования.В группе инфицированных инфицированными смертность составляла 30% на 63 день после заражения, а смертность наблюдалась на 12, 21 и 43 день после заражения.Все животные в контрольной группе выжили до конца эксперимента (рисунок 3С).

Рисунок 3. Клинические результаты у свиней, инфицированных PRRSV-1 Lleida 029_22
(А) Суточная температура прямой кишки после инфицирования (красная пунктирная линия: порог температуры > 41°C; средний ± SD)
(B) Средний ежедневный клинический балл (средний ± SD; одинаковые буквы не указывают на существенные различия между группами, p < 0, 05)
(С) Кривые выживаемости для экспериментальных групп
Примечание: C, контрольная группа; IM, внутримышечная группа; IN, внутриназальная группа.

4Виремия и вирусное выделение у животных, инфицированных PRRSV

Уровень вируемии после инфицирования PRRSV-1 Lleida 029_22 был оценен методом RT- qPCR. РНК PRRSV был обнаружен в сыворотке всех инфицированных животных через 3 дня после инфицирования.с значительными различиями между группами ИМ и ИН по сравнению с контрольной группой, который остался отрицательным (p < 0.05Виремия в группе IN достигла пика через 7 дней после инфицирования,В то время как вирусная нагрузка в группе ИМ была значительно выше, чем в группе ИН и контрольной группы как на 7 день, так и на 14 дней после инфицирования (p < 0).После этого вирусная нагрузка в группе IN постепенно уменьшалась, но все еще была значительно выше, чем в контрольной группе на уровне 28 dpi.

Рисунок 4. Вирусная выделение оценивалась слюной и носовыми/ректальными тампонами. Все инфицированные животные дали положительный результат на вирус при 3 dpi в слюне, носу и ректальных тампонах.

Выделение слюны продолжалось до 14 dpi в группе IM и до конца эксперимента в группе IN (пик в 3 dpi; рисунок 4B).

Выделение из носа достигло максимума в 7 dpi в обеих группах, причем значительно более высокая вирусная нагрузка в группе IM в 7/14 dpi, чем в группе IN (*p<0.05; рисунок 4С).

Ректальное выделение продолжалось до 14 dpi в группе IM и до 35 dpi в группе IN (с небольшим отскоком на 56 dpi), с обеими пиками на 7 dpi (рисунок 4D).

Анализ AUC подтвердил, что вирусная нагрузка во всех образцах из инфицированных групп была значительно выше, чем в контрольной группе,и что нагрузки на носовые тампоны в группе IM были выше, чем в группе IN (*p<0)..05). В целом, выделение PRRSV происходит на ранней стадии и сохраняется после заражения.

5Проверка выделения инфекционного PRRSV из RT-qPCR-положительных образцов

Чтобы подтвердить наличие инфекционного вируса в RT-qPCR-положительных образцах, эксперименты по изоляции вируса (VI) были проведены с использованием клеток PAM-KNU (рисунок 5). the success rate of virus isolation was 100% (10/10) for samples collected between 3 and 14 days post-inoculation (dpi) in the IM group and 100% (10/10) for samples collected between 3 and 7 days post-inoculation (dpi) in the IN groupОднако уровень успеха постепенно снижался через 14 дней после прививки (70%), через 21 день после прививки (55,6%) и через 28 дней после прививки (12,5%).

Рисунок 5. Три инфекционных штамма вируса были успешно изолированы из образцов слюны, собранных у обоих инфицированных животных через 3 дня после заражения (dpi) после двух проходов культуры.Никакой инфекционный вирус не был выделен из носовых или ректальных тампонов..

6. Цитокиновые реакции, вызванные инфекцией PRRSV-1 Lleida 029_22

Образцы сыворотки были собраны в течение первых 14 дней после инфицирования для оценки уровня цитокинов, что показало значительные различия между тремя группами (рисунок 6).Уровни IFN-α были значительно повышены в обеих группах инфекции на 3, 7 и 14 дней после инфицирования (dpi), причем уровни IFN- α в группе IM значительно выше, чем в группе IN на 14 дней после инфицирования (p<0, 05).и IL-6 показали схожие тенденции.: IL- 1α увеличился в группе IN через 3 дня после инфицирования и оставался стабильным,В то время как уровень IL-6 в группе IM был значительно выше, чем в контрольной группе на 7 и 14 день после инфицирования (рис.Следует отметить, что уровень IL-6 был значительно выше в группе IM, чем в группе IN через 14 дней после инфицирования (p<0,05).IL- 1β в обеих группах инфицированных животных показал тенденцию к увеличению.В группе ИМ показаны значительно более высокие уровни, чем в контрольной группе - 3, 7 и 14 дп, в то время как в группе ИН показана значительная разница только в 14 дп (рисунок 6С).

Рисунок 6. Уровни IL-12 были значительно выше в группе IM, чем в группе IN и контрольной группе при 14 dpi (Рисунок 6F).Общая тенденция показала более сильный провоспалительный цитокиновый ответ в группе IM., особенно при уровнях ИЛ-6 7 и 14 дПИ, что положительно коррелировало со 100% смертностью в группе ИМ.

7. Специфические и нейтрализующие реакции антител у животных, инфицированных PRRSV-1 Lleida 029_22

Специфические для PRRSV-1 и PRRSV-2 антитела оценивались с использованием коммерческих наборов ELISA (рисунок 7А).Сероконверсия произошла у 70% животных в группе IM и у 90% животных в группе IN при 14 dpi.Соотношение S/P в обеих группах было значительно выше, чем в контрольной группе (p < 0,05).отскочил на 56 dpiКонтрольная группа оставалась серонегативной на протяжении всего эксперимента (S/P < 0,4).

Рисунок 7. Нейтрализующие тесты на антитела показали, что в группе IN был обнаружен только низкий титр 2 log2 при 28 dpi, который затем постепенно увеличивался до 3,71 log2 при 56 dpi (Рисунок 7B).Титры антител варьировались у отдельных людей в один и тот же момент времени.В контрольной группе не было обнаружено нейтрализующих антител..

8. Выявление и изоляция PRRSV-1 Lleida 029_22 в однородных тканях

RT-qPCR использовался для измерения вирусных нагрузок в различных тканях (рисунок 4F).лимфатические узлы медиастинаВ группе IN вирусные нагрузки значительно варьировались в различных тканях, причем самые высокие нагрузки были в миндалинах и средних лимфатических узлах.общая вирусная нагрузка в группе IN была ниже, чем в группе IM, что может быть связано с различным временем некропсии.Значительная изменчивость нагрузки тканей у инфицированных животных в группе IN также была связана с различными временами смерти (озеленившиеся образцы в 12 лет).Никакая вирусная РНК не была обнаружена ни в одном образце тканей из контрольной группы.

Таблица 1. Ткани, собранные у животных, умерших через 12, 21 или 43 дня после инфицирования, дали положительный результат на AVI.

(Примечание к таблице: в таблице 1 обобщены результаты RT-qPCR и изоляции вируса из образцов тканей. "MLN" обозначает лимфатические узлы средней кишки, а "ILN" - иммунные лимфатические узлы.)

9Патологический и иммуногистохимический анализ инфицированных тканей

Результаты некропсии: у животных, умерших после заражения PRRSV (особенно у тех, которые умерли в течение 12-21 дня после заражения), были значительные системные поражения, включая фиолетовую кожу,гениализированный отек, тяжелая лимфаденопатия, спленомегалия (иногда с фолликулярной гиперплазией) и геморрагия желудка.и красно-коричневые пятна.Примерно у 20% животных с интраназальной инфекцией также развились абсцессы.перикардитУ контрольных животных не наблюдалось крупных поражений.

Рисунок 8. Гистопатологический анализ показал, что показатели интерстициальной пневмонии у животных, умерших рано (12-21 dpi) в группах ИМ и ИН, варьировались от 1,83 до 3,33 пункта.Эти показатели были значительно снижены у животных, убитых при 63 dpi (контрольная группа).Примечательно, что гистологический показатель миндалинов в группе IN был значительно выше, чем в контрольной группе при 63 dpi (p<0,05),но значительных различий в других тканях не наблюдалось (рисунок 8С).

(Клип: на рисунке 8B показаны гистопатологические показатели, а на рисунке 8C сравниваются гистологические показатели различных групп при 63 dpi)

Микроскопическая патология выявила интерстициальную пневмонию (загущение альвеолярной стенки, пролиферация клеток и проникновение воспалительных клеток) в легких всех инфицированных животных.Эксудаты и некротическая ткань были обнаружены в альвеолах.В лимфоидной ткани (лимфоузлы и селезенка) наблюдались тяжелая лимфопения и некроз, сопровождавшиеся повреждением сосудов (например, тромбозом и васкулитом).Инфильтрация периваскулярных воспалительных клеток, отеки и глиоз наблюдались в белом веществе мозга (рисунок 9А).

Иммуногистохимический анализ (IHC) обнаружил антигены PRRSV в макрофагах, а иногда и в пневмоцитах II типа, из легких, лимфатических узлов, миндалинов и селезенки инфицированных животных (рисунок 9B).Вирусные антигены также были обнаружены в периваскулярных воспалительных клетках мозга..

Рисунок 9. Инфекция PRRSV вызывает обширные патологические повреждения легких, лимфоидных тканей и мозга, в основном локализованные в макрофагах, проявляя системные патологические признаки.

Обсуждение

PRRSV имеет ограниченный тропизм для моноцитарных клеточных линий и традиционно изолировался и культивировался с использованием альвеолярных макрофагов (PAM) и клеток MARC-145.ПАМ трудно получить и имеют большую изменчивость от партии к партииВ этом исследовании мы использовали бессмертную клеточную линию PAM-KNU, которая чувствительна к определенным полевым штаммам, вместо PAM.Мы успешно изолировали штамм Ллеида 029_22В настоящее время не существует универсальной клеточной линии, подходящей для всех штаммов PRRSV.и необходимы дальнейшие усилия по выявлению более подходящих клеточных линий для изоляции различных штаммов.

Заключение

Это исследование успешно установило модель интраназальной инфекции с очень вирулентным штаммом PRRSV-1.и вирумии) очень похожи на наблюдаемые в полевых вспышках.Ключевым результатом было то, что путь заражения значительно влияет на результат: внутримышечная инфекция приводит к 100% острой смертности.В то время как интраназальная (IN) инфекция имела смертность только 30%, и инфицированные свиньи в конечном итоге полностью выздоровели.Это значительное различие подчеркивает риск того, что практика инъекций внутрифермерной медицины может значительно усугубить тяжесть эпидемии через нозокомиальную передачу..