berita perusahaan tentang Virus sindrom reproduksi dan pernapasan babi tipe 1 sangat virulent pada babi

Sindrom reproduksi dan pernapasan babi (PRRS) tetap menjadi salah satu penyakit menular paling penting yang mempengaruhi industri babi global.Munculnya strain PRRSV-1 yang sangat patogenik baru-baru ini di Spanyol timur laut (pertama kali terdeteksi pada tahun 2020) telah menimbulkan tantangan baru untuk pengendalian penyakitMeskipun strain virulent ini menghancurkan di lapangan, karakteristik eksperimental komprehensif mereka belum sepenuhnya diselidiki.studi ini secara sistematis menyelidiki asal-usul genetik, karakteristik replikasi in vitro dan mekanisme patogenitas dari strain PRRSV-1 Spanyol yang baru muncul, sangat patogen, Lleida 029_22,melalui dua jalur infeksi (intramuskular dan intranasal).

Sebuah studi baru-baru ini yang diterbitkan di Wiley Online Library menganalisis karakteristik genetik dan patogenitas strain PRRSV-1 yang sangat patogen Lleida 029_22 pada babi.Analisis filogenetik menunjukkan bahwa strain Lleida 029_22 milik klade baru yang terkait dengan wabah PRRSV-1 Rosalia dan homolog dengan strain Italia yang sangat patogen PR40Strain ini mereplikasi secara efisien pada makrofag alveolar babi dan sel PAM-KNU in vitro, tetapi tidak pada sel MARC-145.

Untuk menilai patogenisitasnya, kelinci berusia delapan minggu diinokulasi dengan dosis yang sama dari 2×105 TCID5 Lleida 029_22 melalui suntikan intramuskular (IM) dan intranasal (IN).Inokulasi IM menghasilkan 100% mortalitas dalam 14 hari, disertai dengan tinggi viremia, tinggi viral shedding, tingkat yang signifikan meningkat dari sitokin pro-inflamasi (khususnya IL-6), dan lesi paru-paru yang parah.babi yang divaksinasi dengan vaksin IN memiliki tingkat kematian yang lebih rendah (30%) dan gejala klinis moderatPara penyintas sembuh setelah 63 hari, tetapi menunjukkan viremia dan pertumpahan yang berkepanjangan, dan tingkat rendah sitokin proinflamasi dan antibodi netralisasi dari hari ke-28 dan seterusnya.

Menariknya, IN Infeksi dengan teliti menggarisbawahi gejala klinis dari wabah yang disebabkan oleh strain Rosalia yang sangat virulent di peternakan Spanyol,sementara infeksi IM menyoroti risiko penularan nosocomial.

Latar Belakang: Virus sindrom reproduksi dan pernapasan babi (PRRSV) adalah patogen utama yang mengancam industri babi global.Variabilitas dan keanekaragaman yang tinggi membuat vaksin yang ada tidak konsisten efektifPada tahun 2020, strain PRRSV-1 yang sangat virulent bernama "Rosalia" muncul di Spanyol dan menyebar dengan cepat, menyebabkan kerugian parah (misalnya, peningkatan mortalitas selama musim tanam).Analisis genetik menunjukkan bahwa itu mungkin berasal dari strain Italia yang sangat virulent, PR40, melalui rekombinasi. Strain ini menyebabkan tingkat aborsi dan kematian yang tinggi (> 20%) di lapangan, tetapi data eksperimen sistematis kurang.

Tujuan dan Metode Studi: Studi ini bertujuan untuk mengkarakterisasi secara komprehensif strain PRRSV-1 yang sangat virulent yang diisolasi dari wabah Rosalia menggunakan percobaan in vitro dan in vivo.Babi berusia delapan minggu diinokulasi melalui jalur infeksi intramuskular (IM) dan intranasal (IN) (IM adalah jalur eksperimen yang umum digunakan), sedangkan IN mensimulasikan infeksi alami).

Tujuan pengujian: dokumentasi rinci tentang tanda-tanda klinis dan mortalitas; pemeriksaan patologis kasar, mikroskopis, dan immunohistochemical dari babi yang meninggal/necropsied; beban virus dalam serum,air liur, swab hidung, swab rektum, dan jaringan, serta isolasi virus, dilakukan untuk memahami dinamika virus dan transmisibilitas;dan respon kekebalan dinilai dengan menganalisis tingkat antibodi netralizing dan spesifik PRRSV, serta kadar sitokin serum.

Pentingnya Utama: Studi ini akan memberikan model eksperimen utama dan dasar data untuk mengevaluasi efektivitas vaksin yang ada, mengembangkan vaksin baru,dan lebih memahami patogenesis dari strain yang sangat virulent ini.

Hasil

1Analisis filogenetik dari strain PRRSV-1 dan Karakterisasi Urutan Asam Amino Nsp2

Karakteristik Genomik dan Posisi Filogenetik:

Urutan mendalam (286×) mengkonfirmasi bahwa genom strain PRRSV-1 Lleida 029_22 memiliki panjang 14.858 nt (Gambar 1A), yang secara filogenetik milik garis keturunan subtipe 1 PRRSV-1.Strain ini membentuk klad independen dari tiga strain lain yang terkait dengan wabah Rosalia (Gambar 1A), berbagi identitas nukleotida 96, 61% - 97, 26%, dan homolog dengan strain PR40 yang sangat patogen.

Karakterisasi penghapusan Nsp2:

Protein Nsp2 dari strain Lleida 029_22 menunjukkan penghapusan asam amino 63 (posisi 317-379 relatif terhadap strain Lelystad) (Gambar 1B).sementara penghapusan dalam strain homolog, PR40, bahkan lebih besar (Gambar 1A), menunjukkan bahwa variasi genetik ini muncul pada awal evolusi klade.

Gambar 1. Pohon filogenetik dari PRRSV-1 Lleida strain 029_22 dan penyelarasan urutan Nsp2
(A) Pohon filogenetik kemungkinan maksimum yang dibangun berdasarkan seluruh urutan genom (model GTR, 1000 tes bootstrap).

▲: Lleida 029_22 strain yang digunakan dalam penelitian ini; ●: Rosalia strain-outbreak-associated.
(B) Separatif Nsp2 urutan asam amino keselarasan (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).

Strain yang dibandingkan: Lleida 029_22, strain yang terkait dengan wabah Rosalia, strain PR40 yang sangat virulent, dan strain prototipe Lelystad.
* Catatan: Nsp2, protein nonstruktural 2; PRRSV-1, virus sindrom reproduksi dan pernapasan babi tipe 1.

2Karakteristik replikasi in vitro dari strain PRRSV-1 Lleida 029_22

Pertama, karakteristik replikasi strain Lleida 029_22 dievaluasi in vitro. strain ini mereplikasi secara efisien pada sel PAM dan sel PAM-KNU, tetapi tidak pada sel MARC-145 (Gambar 2A).Kurva pertumbuhan virus pada tiga jenis sel menunjukkan titer virus yang serupa pada sel PAM dan sel PAM-KNU.Setelah 72 jam, kedua jenis sel mencapai titer virus sekitar 105TCID50/ml.Sel MARC-145 tidak mampu mempertahankan infeksi virus yang efisien, dengan titer virus turun ke tingkat yang tidak terdeteksi setelah 72 jam.

Gambar 2. Kinetik Pertumbuhan PRRSV-1 Lleida 029_22 dalam Tiga Garis Sel
(A) Mikroskopi fluoresensi 72 jam setelah infeksi (MOI = 0.1, pewarnaan dengan anti-N protein antibodi; 20x objektif)
(B) Dinamika titer virus dalam sel PAM-KNU (rata-rata ± SD dari tiga percobaan independen)
* Catatan: MOI, multiplicitas infeksi; PAM, makrofag alveolar primer; PRRSV-1, virus sindrom reproduksi dan pernapasan babi tipe 1.

3. Manifestasi klinis dan mortalitas pada babi yang terinfeksi Lleida 029_22

Patogenitas PRRSV-1 Lleida 029_22 dinilai dengan cara inokulasi intramuskular (IM) dan intranasal (IN).Lebih dari 41°C pada 7 dpiKelompok vaksinasi intranasal menunjukkan demam yang lebih ringan, hanya sebentar melebihi 41°C pada 5 hari setelah vaksinasi, diikuti oleh pola demam intermiten.Kelompok kontrol tidak menunjukkan suhu tubuh yang abnormal sepanjang percobaan (Gambar 3A).

Pengamatan klinis menunjukkan bahwa kelompok yang terinfeksi IM mengalami kesulitan pernapasan akut, gejala neurologis, disnea parah, dan sianosis telinga dan skrotum,sementara kelompok yang terinfeksi IN terutama menunjukkanGejala klinis tambahan termasuk bulu yang berserakan, edema (paling jelas pada anggota badan dan leher), peradangan sendi, dan penurunan kondisi tubuh secara keseluruhan pada kedua kelompok,tapi ini lebih parah di kelompok IMManifestasi klinis yang parah ini terutama terkonsentrasi antara 12 dan 14 hari setelah vaksinasi, bertepatan dengan periode kematian tinggi atau eutanasia karena alasan kesejahteraan.

Secara keseluruhan, skor klinis pada kelompok yang terinfeksi IM secara signifikan lebih tinggi daripada pada kelompok yang terinfeksi IN pada 11, 12, dan 14 hari setelah vaksinasi (p < 0, 05),puncak pada 14 hari setelah vaksinasi (Gambar 3B)Skor klinis pada kelompok IN lebih rendah, mencapai puncaknya pada 13 hari setelah infeksi (dpi).namun skor tetap jauh lebih tinggi daripada kelompok kontrol (p < 0.05). Tidak ada gejala klinis yang diamati pada kelompok kontrol selama percobaan (Gambar 3B).

Linear mixed model analysis (accounting for the non-independence of observations from the same animal at different time points) revealed that group- and day-specific variables significantly influenced body temperature and clinical scores during the first 14 days (p < 0.05). Perbedaan yang signifikan ditemukan antara kelompok IM dan IN, serta antara kedua kelompok infeksi dan kelompok kontrol.

Analisis kelangsungan hidup menunjukkan bahwa semua hewan dalam kelompok infeksi IM meninggal sebelum 14 hari setelah infeksi, dengan tingkat kematian 100%.Kematian alami atau disebabkan terkonsentrasi antara 12 dan 14 hari setelah infeksiPada kelompok infeksi IN, mortalitas adalah 30% pada 63 hari setelah infeksi, dengan kematian terjadi pada 12, 21, dan 43 hari setelah infeksi.Semua hewan dalam kelompok kontrol bertahan sampai akhir percobaan (Gambar 3C).

Gambar 3. Hasil klinis pada babi yang terinfeksi PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) Suhu rektum harian setelah infeksi (Garis bergaris merah: Ambang demam > 41°C; Rata-rata ± SD)
(B) Skor Klinis Rata-rata Harian (Rata ± SD; Huruf yang sama tidak menunjukkan perbedaan signifikan antara kelompok, p < 0,05)
(C) Kurva kelangsungan hidup untuk kelompok eksperimen
Catatan: C, kelompok kontrol; IM, kelompok intramuskular; IN, kelompok intranasal.

4Viremia dan Penghapusan Virus pada Hewan yang Terinfeksi PRRSV

Tingkat viremia setelah infeksi PRRSV-1 Lleida 029_22 dinilai dengan RT-qPCR.dengan perbedaan signifikan antara kelompok IM dan IN dibandingkan dengan kelompok kontrol, yang tetap negatif (p < 0.05Viremia pada kelompok IN mencapai puncaknya pada 7 hari setelah infeksi,sementara beban virus dalam kelompok IM secara signifikan lebih tinggi daripada dalam kelompok IN dan kontrol pada 7 dan 14 hari setelah infeksi (p < 0)..05). Setelah itu, viral load dalam kelompok IN berangsur-angsur menurun, tetapi masih jauh lebih tinggi daripada dalam kelompok kontrol pada 28 dpi.

Gambar 4. Penyelebaran virus dinilai dengan air liur dan swab hidung/rektum. Semua hewan yang terinfeksi diuji positif virus pada 3 dpi dalam air liur, hidung, dan swab rektum.

Penurunan air liur berlanjut sampai 14 dpi pada kelompok IM dan sampai akhir percobaan pada kelompok IN (puncak pada 3 dpi; Gambar 4B).

Pencemaran hidung mencapai puncaknya pada 7 dpi di kedua kelompok, dengan beban virus yang jauh lebih tinggi di kelompok IM pada 7/14 dpi daripada di kelompok IN (*p<0.05; Gambar 4C).

Pencemaran rektum berlanjut hingga 14 dpi di kelompok IM dan hingga 35 dpi di kelompok IN (dengan sedikit rebound pada 56 dpi), dengan kedua puncak pada 7 dpi (Gambar 4D).

Analisis AUC mengkonfirmasi bahwa beban virus di semua sampel dari kelompok yang terinfeksi secara signifikan lebih tinggi daripada di kelompok kontrol,dan bahwa beban swab hidung di kelompok IM lebih tinggi daripada di kelompok IN (*p<0.05). Singkatnya, pembebasan PRRSV terjadi lebih awal dan terus berlanjut setelah infeksi.

5Verifikasi isolasi PRRSV menular dari sampel RT-qPCR-positif

Untuk mengkonfirmasi adanya virus menular pada sampel positif RT-qPCR, eksperimen isolasi virus (VI) dilakukan menggunakan sel PAM-KNU (Gambar 5). the success rate of virus isolation was 100% (10/10) for samples collected between 3 and 14 days post-inoculation (dpi) in the IM group and 100% (10/10) for samples collected between 3 and 7 days post-inoculation (dpi) in the IN groupNamun, tingkat keberhasilan secara bertahap menurun pada 14 hari pasca vaksinasi (70%), 21 hari pasca vaksinasi (55.6%), dan 28 hari pasca vaksinasi (12.5%).

Gambar 5. Tiga strain virus menular berhasil diisolasi dari sampel air liur yang dikumpulkan dari kedua hewan yang terinfeksi pada 3 hari setelah infeksi (dpi) setelah dua jalur kultur.Tidak ada virus menular yang diisolasi dari tisu hidung atau rektum.

6. Respon sitokin yang diinduksi oleh infeksi PRRSV-1 Lleida 029_22

Sampel serum dikumpulkan selama 14 hari pertama setelah infeksi untuk menilai kadar sitokin, mengungkapkan perbedaan yang signifikan di antara ketiga kelompok (Gambar 6).kadar IFN-α secara signifikan meningkat di kedua kelompok infeksi pada 3, 7, dan 14 hari setelah infeksi (dpi), dengan tingkat IFN-α dalam kelompok IM secara signifikan lebih tinggi daripada dalam kelompok IN pada 14 hari setelah infeksi (p<0,05).dan IL-6 menunjukkan tren yang sama: IL-1α meningkat pada kelompok IN 3 hari setelah infeksi dan tetap stabil,sedangkan tingkat IL-6 dalam kelompok IM secara signifikan lebih tinggi daripada dalam kelompok kontrol pada hari ke-7 dan ke-14 setelah infeksi (Gambar 6B)Penting untuk dicatat, kadar IL-6 secara signifikan lebih tinggi pada kelompok IM dibandingkan dengan kelompok IN pada 14 hari setelah infeksi (p<0,05).IL-1β pada kedua kelompok hewan yang terinfeksi menunjukkan peningkatan, dengan kelompok IM menunjukkan tingkat yang jauh lebih tinggi daripada kelompok kontrol pada 3, 7, dan 14 dpi sedangkan kelompok IN menunjukkan perbedaan yang signifikan hanya pada 14 dpi (Gambar 6C).

Gambar 6. kadar IL-12 secara signifikan lebih tinggi pada kelompok IM dibandingkan pada kelompok IN dan kelompok kontrol pada 14 dpi (Gambar 6F).Tren keseluruhan menunjukkan respon sitokin pro-inflamasi yang lebih kuat pada kelompok IM., terutama pada tingkat IL-6 pada 7 dan 14 dpi, yang berkorelasi positif dengan tingkat kematian 100% dalam kelompok IM.

7. Respon antibodi spesifik dan netral pada hewan yang terinfeksi PRRSV-1 Lleida 029_22

Antibodi spesifik PRRSV-1 dan PRRSV-2 dinilai menggunakan kit ELISA komersial (Gambar 7A).Serokonversi terjadi pada 70% hewan dalam kelompok IM dan pada 90% hewan dalam kelompok IN pada 14 dpi.Tingkat antibodi dalam kelompok IN mulai menurun pada 21 dpi, tetap stabil pada 42 dpi,Rebound pada 56 dpiKelompok kontrol tetap seronegatif sepanjang percobaan (S/P < 0, 4).

Gambar 7. pengujian antibodi netral menunjukkan bahwa pada kelompok IN, hanya titer rendah 2 log2 terdeteksi pada 28 dpi, yang kemudian secara bertahap meningkat menjadi 3.71 log2 pada 56 dpi (Gambar 7B).Titer antibodi bervariasi di antara individu pada titik waktu yang sama, dan munculnya antibodi netralisasi bertepatan dengan pembersihan virus infeksi dari serum setelah 28 dpi (Gambar 4B)..

8. Deteksi dan isolasi PRRSV-1 Lleida 029_22 pada jaringan homogenat

RT-qPCR digunakan untuk mengukur beban virus di berbagai jaringan (Gambar 4F).kelenjar getah bening mediastinalDalam kelompok IN, beban virus bervariasi secara signifikan di seluruh jaringan, dengan beban tertinggi di amandel dan kelenjar getah bening mediastinal.jumlah viral total dalam kelompok IN lebih rendah daripada dalam kelompok IM, yang mungkin terkait dengan waktu yang berbeda dari nekropsi.Variabilitas yang signifikan dalam beban jaringan pada hewan yang terinfeksi dalam kelompok IN juga dikaitkan dengan waktu kematian yang berbeda (contoh-contoh yang beruban pada usia 12 bulan).Tidak ada RNA virus yang terdeteksi pada sampel jaringan dari kelompok kontrol.

Tabel 1. Jaringan yang dikumpulkan dari hewan yang mati pada 12, 21, atau 43 hari setelah infeksi diuji positif untuk aVI.

(Catatan Tabel: Tabel 1 meringkas hasil RT-qPCR dan isolasi virus dari sampel jaringan. "MLN" menunjukkan kelenjar getah bening mediastinal, dan "ILN" menunjukkan kelenjar getah bening inguinal.)

9. Analisis patologis dan imunohistokimia jaringan yang terinfeksi PRRSV

Temuan nekropsi: Hewan yang meninggal setelah infeksi PRRSV (terutama yang meninggal antara 12 dan 21 hari setelah infeksi) menunjukkan lesi sistemik yang signifikan, termasuk kulit ungu,edema umum, limfadenopati parah, splenomegalia (kadang-kadang dengan hiperplasia folikel), dan pendarahan lambung.dan makula coklat kemerahan, konsisten dengan pneumonia interstisial, dengan lesi yang lebih parah pada hewan yang meninggal dini (Gambar 8A).PerikarditisTidak ada lesi besar yang diamati pada hewan kontrol.

Gambar 8. Analisis histopathologi menunjukkan bahwa skor pneumonia interstisial pada hewan yang meninggal dini (12-21 dpi) dalam kelompok IM dan IN berkisar antara 1,83 hingga 3,33 poin.skor ini secara signifikan berkurang pada hewan yang disembelih pada 63 dpi (kelompok kontrol)Secara khusus, skor histologis amandel dalam kelompok IN secara signifikan lebih tinggi daripada dalam kelompok kontrol pada 63 dpi (p<0.05),tetapi tidak ada perbedaan yang signifikan yang diamati pada jaringan lain (Gambar 8C).

(Kapitulasi: Gambar 8B menunjukkan skor histopatologis, dan Gambar 8C membandingkan skor histologis dari berbagai kelompok pada 63 dpi)

Patologi mikroskopik mengungkapkan pneumonia interstisial (penekanan dinding alveolar, proliferasi sel, dan infiltrasi sel peradangan) di paru-paru semua hewan yang terinfeksi.Eksudat dan jaringan nekrosis ada di dalam alveolijaringan limfosa ( kelenjar getah bening dan limpa) menunjukkan limfopenia dan nekrosis yang parah, disertai dengan kerusakan pembuluh darah (misalnya, trombosis dan vaskulitis).Infiltrasi sel inflamasi perivaskular, edema, dan gliosis diamati pada zat putih otak (Gambar 9A).

Analisis imunohistokimia (IHC) mendeteksi antigen PRRSV pada makrofag, dan kadang-kadang pada pneumosit tipe II, dari paru-paru, kelenjar getah bening, amandel, dan limpa hewan yang terinfeksi (Gambar 9B).Antigen virus juga terdeteksi pada sel perivaskular peradangan di otak.

Gambar 9. Infeksi PRRSV menyebabkan kerusakan patologis yang luas pada paru-paru, jaringan limfoid, dan otak, terutama terlokalisasi dalam makrofag, menunjukkan fitur patologis sistemik.

Pembahasan

PRRSV memiliki tropisme terbatas untuk garis sel monositik dan secara tradisional telah diisolasi dan dibudidayakan menggunakan makrofag alveolar (PAM) dan sel MARC-145.PAM sulit diperoleh dan memiliki variabilitas besar dari batch ke batchDalam studi ini, kami menggunakan garis sel PAM-KNU yang abadi, yang sensitif terhadap strain medan tertentu, alih-alih PAM.Kami berhasil mengisolasi varian Lleida 029_22Saat ini tidak ada garis sel universal yang cocok untuk semua strain PRRSV,dan upaya masa depan diperlukan untuk mengidentifikasi garis sel yang lebih cocok untuk isolasi berbagai strain.

Kesimpulan

Studi ini berhasil membangun model infeksi intranasal dengan strain PRRSV-1 yang sangat virulent.dan viremia) sangat mirip dengan yang diamati dalam wabah lapanganTemuan utama adalah bahwa rute infeksi secara signifikan mempengaruhi hasil: infeksi intramuskular (IM) menghasilkan 100% mortalitas akut,sementara infeksi intranasal (IN) memiliki tingkat kematian hanya 30%, dan babi yang terinfeksi akhirnya sembuh sepenuhnya.Perbedaan signifikan ini menyoroti risiko bahwa praktik injeksi IM di peternakan dapat secara signifikan memperburuk tingkat keparahan epidemi melalui transmisi nosocomial..