La sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRS) rimane una delle malattie infettive più importanti che colpiscono l'industria suinicola globale. La recente comparsa di un ceppo PRRSV-1 altamente patogeno nel nord-est della Spagna (rilevato per la prima volta nel 2020) ha presentato nuove sfide per il controllo della malattia. Sebbene questi ceppi virulenti siano devastanti sul campo, la loro completa caratterizzazione sperimentale deve ancora essere completamente studiata. Pertanto, questo studio ha sistematicamente studiato le origini genetiche, le caratteristiche di replicazione in vitro e i meccanismi di patogenicità del ceppo PRRSV-1 spagnolo altamente patogeno, Lleida 029_22, di nuova comparsa, attraverso due vie di infezione (intramuscolare e intranasale).
Un recente studio pubblicato su Wiley Online Library ha analizzato le caratteristiche genetiche e la patogenicità del ceppo PRRSV-1 altamente patogeno Lleida 029_22 nei suini. L'analisi filogenetica ha rivelato che il ceppo Lleida 029_22 appartiene a un nuovo clade associato all'epidemia di PRRSV-1 Rosalia ed è omologo al ceppo italiano altamente patogeno PR40. Questo ceppo si replica in modo efficiente nei macrofagi alveolari suini e nelle cellule PAM-KNU in vitro, ma non nelle cellule MARC-145.
Per valutare la sua patogenicità, suinetti di otto settimane sono stati inoculati con la stessa dose di 2×10⁵ TCID⁵ di Lleida 029_22 tramite iniezioni intramuscolari (IM) e intranasali (IN). L'inoculazione IM ha determinato una mortalità del 100% entro 14 giorni, accompagnata da elevata viremia, elevata eliminazione virale, livelli significativamente elevati di citochine proinfiammatorie (in particolare IL-6) e lesioni polmonari gravi. Al contrario, i suini vaccinati con il vaccino IN hanno avuto un tasso di mortalità inferiore (30%) e segni clinici moderati. I sopravvissuti si sono ripresi dopo 63 giorni, ma hanno mostrato viremia ed eliminazione prolungate e bassi livelli di citochine proinfiammatorie e anticorpi neutralizzanti dal giorno 28 in poi.
È interessante notare che l'infezione IN ha fedelmente riprodotto i sintomi clinici di un'epidemia causata dal ceppo Rosalia altamente virulento negli allevamenti spagnoli, mentre l'infezione IM ha evidenziato il rischio di trasmissione nosocomiale.
Contesto: Il virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina (PRRSV) è un importante agente patogeno che minaccia l'industria suinicola globale. La sua elevata variabilità e diversità rendono i vaccini esistenti in modo incoerente efficaci. Nel 2020, in Spagna è emerso un ceppo PRRSV-1 altamente virulento denominato "Rosalia" che si è diffuso rapidamente, causando gravi perdite (ad esempio, aumento della mortalità durante la stagione di crescita). L'analisi genetica suggerisce che probabilmente è derivato da un ceppo italiano altamente virulento, PR40, attraverso la ricombinazione. Questo ceppo causa alti tassi di aborto e mortalità (>20%) sul campo, ma mancano dati sperimentali sistematici.
Obiettivi e metodi dello studio: Questo studio mirava a caratterizzare in modo completo il ceppo PRRSV-1 altamente virulento isolato dall'epidemia di Rosalia utilizzando esperimenti in vitro e in vivo. Suinetti di otto settimane sono stati inoculati tramite entrambe le vie di infezione intramuscolare (IM) e intranasale (IN) (IM è la via sperimentale comunemente utilizzata, mentre IN simula l'infezione naturale).
Obiettivi del test: Documentazione dettagliata dei segni clinici e della mortalità; esami patologici macroscopici, microscopici e immunoistochimici dei suini deceduti/necropsiati; carichi virali nel siero, nella saliva, nei tamponi nasali, nei tamponi rettali e nei tessuti, nonché l'isolamento del virus, sono stati eseguiti per comprendere le dinamiche virali e la trasmissibilità; e le risposte immunitarie sono state valutate analizzando i livelli di anticorpi specifici e neutralizzanti per PRRSV, nonché i livelli di citochine sieriche.
Significato chiave: Questo studio fornirà un modello sperimentale chiave e una base di dati per valutare l'efficacia dei vaccini esistenti, sviluppare nuovi vaccini e comprendere ulteriormente la patogenesi di questo ceppo altamente virulento.
Risultati
1. Analisi filogenetica dei ceppi PRRSV-1 e caratterizzazione della sequenza aminoacidica di Nsp2
Caratteristiche genomiche e posizionamento filogenetico:
Il sequenziamento profondo (286×) ha confermato che il genoma del ceppo PRRSV-1 Lleida 029_22 è lungo 14.858 nt (Figura 1A), appartenente filogeneticamente al lignaggio del sottotipo 1 di PRRSV-1. Questo ceppo forma un clade indipendente da altri tre ceppi associati all'epidemia di Rosalia (Figura 1A), condividendo un'identità nucleotidica del 96,61%-97,26% ed è omologo al ceppo PR40 altamente patogeno.
Caratterizzazione della delezione di Nsp2:
La proteina Nsp2 del ceppo Lleida 029_22 mostra una delezione di 63 aminoacidi (posizioni 317-379 rispetto al ceppo Lelystad) (Figura 1B). Questa delezione è conservata all'interno del clade Rosalia, mentre la delezione nel suo ceppo omologo, PR40, è ancora più grande (Figura 1A), suggerendo che questa variazione genetica è sorta precocemente nell'evoluzione del clade.
Figura 1. Albero filogenetico del ceppo PRRSV-1 Lleida 029_22 e allineamento della sequenza Nsp2
(A) Albero filogenetico di massima verosimiglianza costruito sulla base della sequenza dell'intero genoma (modello GTR, 1000 test bootstrap).
▲: ceppo Lleida 029_22 utilizzato in questo studio; ●: ceppo associato all'epidemia di Rosalia.
(B) Allineamento parziale della sequenza aminoacidica di Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).
Ceppi confrontati: Lleida 029_22, ceppo associato all'epidemia di Rosalia, ceppo PR40 altamente virulento e ceppo prototipo Lelystad.
*Nota: Nsp2, proteina non strutturale 2; PRRSV-1, virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina di tipo 1.
2. Caratteristiche di replicazione in vitro del ceppo PRRSV-1 Lleida 029_22
Innanzitutto, le caratteristiche di replicazione del ceppo Lleida 029_22 sono state valutate in vitro. Questo ceppo si è replicato in modo efficiente nei PAM e nelle cellule PAM-KNU, ma non nelle cellule MARC-145 (Figura 2A). Le curve di crescita virale nei tre tipi di cellule hanno mostrato titoli virali simili nei PAM e nelle cellule PAM-KNU, sebbene queste ultime avessero titoli leggermente inferiori (Figura 2B). A 72 ore, entrambi i tipi di cellule hanno raggiunto titoli virali di circa 10⁵TCID₅₀/mL. Al contrario, le cellule MARC-145 non sono state in grado di sostenere un'infezione virale efficiente, con i titoli virali che sono scesi a livelli non rilevabili dopo 72 ore.
Figura 2. Cinetica di crescita di PRRSV-1 Lleida 029_22 in tre linee cellulari
(A) Microscopia a fluorescenza 72 ore dopo l'infezione (MOI = 0,1, colorazione con anticorpo anti-proteina N; obiettivo 20x)
(B) Dinamica dei titoli virali nelle cellule PAM-KNU (media ± DS di tre esperimenti indipendenti)
*Nota: MOI, moltiplicità di infezione; PAM, macrofagi alveolari primari; PRRSV-1, virus della sindrome riproduttiva e respiratoria suina di tipo 1.
3. Manifestazioni cliniche e mortalità nei suini infettati da Lleida 029_22
La patogenicità di PRRSV-1 Lleida 029_22 è stata valutata tramite vie di inoculazione intramuscolare (IM) e intranasale (IN). I suini nel gruppo IM hanno mostrato un aumento della temperatura corporea a partire da 1 dpi, superando i 41°C a 7 dpi e persistendo fino a 13 dpi. Il gruppo di inoculazione intranasale ha mostrato una febbre più lieve, superando brevemente i 41°C a 5 giorni post-inoculazione, seguita da un andamento febbrile intermittente. Il gruppo di controllo non ha mostrato temperature corporee anomale durante l'esperimento (Figura 3A).
Le osservazioni cliniche hanno rivelato che il gruppo infettato da IM ha manifestato distress respiratorio acuto, sintomi neurologici, dispnea grave e cianosi delle orecchie e dello scroto, mentre il gruppo infettato da IN ha presentato principalmente dispnea moderata e persistente. Ulteriori segni clinici includevano pelo irsuto, edema (più pronunciato sugli arti e sul collo), infiammazione articolare e deterioramento generale delle condizioni fisiche in entrambi i gruppi, ma questi erano più gravi nel gruppo IM. Queste gravi manifestazioni cliniche erano concentrate principalmente tra i 12 e i 14 giorni post-inoculazione, in coincidenza con il periodo di alta mortalità o eutanasia per motivi di benessere.
Nel complesso, i punteggi clinici nel gruppo infettato da IM erano significativamente più alti di quelli nel gruppo infettato da IN a 11, 12 e 14 giorni post-inoculazione (p < 0,05), raggiungendo il picco a 14 giorni post-inoculazione (Figura 3B). I punteggi clinici nel gruppo IN erano inferiori, raggiungendo il picco a 13 giorni post-infezione (dpi). I sintomi sono gradualmente diminuiti da allora, ma i punteggi sono rimasti significativamente più alti di quelli nel gruppo di controllo (p < 0,05). Nessun sintomo clinico è stato osservato nel gruppo di controllo durante l'esperimento (Figura 3B).
L'analisi del modello misto lineare (tenendo conto della non indipendenza delle osservazioni dallo stesso animale in diversi momenti) ha rivelato che le variabili specifiche del gruppo e del giorno hanno influenzato in modo significativo la temperatura corporea e i punteggi clinici durante i primi 14 giorni (p < 0,05). Sono state riscontrate differenze significative tra i gruppi IM e IN, nonché tra entrambi i gruppi di infezione e il gruppo di controllo.
L'analisi di sopravvivenza ha mostrato che tutti gli animali nel gruppo di infezione IM sono morti prima di 14 giorni post-infezione, con un tasso di mortalità del 100%. Le morti naturali o indotte sono state concentrate tra i 12 e i 14 giorni post-infezione. Nel gruppo di infezione IN, la mortalità è stata del 30% entro 63 giorni post-infezione, con decessi avvenuti a 12, 21 e 43 giorni post-infezione. Tutti gli animali nel gruppo di controllo sono sopravvissuti fino alla fine dell'esperimento (Figura 3C).
Figura 3. Esiti clinici nei suini infettati da PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) Temperature rettali giornaliere post-infezione (linea tratteggiata rossa: soglia di febbre >41°C; media ± DS)
(B) Punteggio clinico medio giornaliero (media ± DS; lettere identiche indicano nessuna differenza significativa tra i gruppi, p < 0,05)
(C) Curve di sopravvivenza per i gruppi sperimentali
Nota: C, gruppo di controllo; IM, gruppo intramuscolare; IN, gruppo intranasale.
4. Viremia ed eliminazione virale negli animali infettati da PRRSV
I livelli di viremia a seguito dell'infezione da PRRSV-1 Lleida 029_22 sono stati valutati mediante RT-qPCR. L'RNA PRRSV è stato rilevato nel siero di tutti gli animali infetti a 3 giorni post-infezione, con differenze significative tra i gruppi IM e IN rispetto al gruppo di controllo, che è rimasto negativo (p < 0,05; Figura 4A). La viremia nel gruppo IN ha raggiunto il picco a 7 giorni post-infezione, mentre i carichi virali nel gruppo IM erano significativamente più alti di quelli nei gruppi IN e di controllo sia a 7 che a 14 giorni post-infezione (p < 0,05). Successivamente, il carico virale nel gruppo IN è gradualmente diminuito, ma era ancora significativamente più alto di quello nel gruppo di controllo a 28 dpi.
Figura 4. L'eliminazione virale è stata valutata mediante tamponi salivari e nasali/rettali. Tutti gli animali infetti sono risultati positivi al virus a 3 dpi nei tamponi salivari, nasali e rettali.
L'eliminazione salivare è continuata fino a 14 dpi nel gruppo IM e fino alla fine dell'esperimento nel gruppo IN (picco a 3 dpi; Figura 4B).
L'eliminazione nasale ha raggiunto il picco a 7 dpi in entrambi i gruppi, con carichi virali significativamente più alti nel gruppo IM a 7/14 dpi rispetto al gruppo IN (*p<0,05; Figura 4C).
L'eliminazione rettale è continuata fino a 14 dpi nel gruppo IM e fino a 35 dpi nel gruppo IN (con un leggero rimbalzo a 56 dpi), con entrambi i picchi a 7 dpi (Figura 4D).
L'analisi AUC ha confermato che i carichi virali in tutti i campioni dei gruppi infetti erano significativamente più alti di quelli nel gruppo di controllo e che i carichi dei tamponi nasali nel gruppo IM erano più alti di quelli nel gruppo IN (*p<0,05). In sintesi, l'eliminazione di PRRSV si verifica precocemente ed è sostenuta dopo l'infezione.
5. Verifica dell'isolamento di PRRSV infettivo da campioni positivi alla RT-qPCR
Per confermare la presenza di virus infettivo nei campioni positivi alla RT-qPCR, sono stati eseguiti esperimenti di isolamento del virus (VI) utilizzando cellule PAM-KNU (Figura 5). Per i campioni di siero, il tasso di successo dell'isolamento del virus è stato del 100% (10/10) per i campioni prelevati tra 3 e 14 giorni post-inoculazione (dpi) nel gruppo IM e del 100% (10/10) per i campioni prelevati tra 3 e 7 giorni post-inoculazione (dpi) nel gruppo IN. Tuttavia, il tasso di successo è gradualmente diminuito a 14 giorni post-inoculazione (70%), 21 giorni post-inoculazione (55,6%) e 28 giorni post-inoculazione (12,5%).
Figura 5. Tre ceppi virali infettivi sono stati isolati con successo da campioni di saliva prelevati da entrambi gli animali infetti a 3 giorni post-infezione (dpi) dopo due passaggi di coltura. Nessun virus infettivo è stato isolato da tamponi nasali o rettali.
6. Risposte citochiniche indotte dall'infezione da PRRSV-1 Lleida 029_22
I campioni di siero sono stati prelevati durante i primi 14 giorni post-infezione per valutare i livelli di citochine, rivelando differenze significative tra i tre gruppi (Figura 6). I livelli di IFN-α sono stati significativamente elevati in entrambi i gruppi di infezione a 3, 7 e 14 giorni post-infezione (dpi), con i livelli di IFN-α nel gruppo IM significativamente più alti che nel gruppo IN a 14 giorni post-infezione (p<0,05). Le citochine proinfiammatorie IL-1α, IL-12 e IL-6 hanno mostrato andamenti simili: IL-1α è aumentata nel gruppo IN a 3 giorni post-infezione ed è rimasta stabile, mentre i livelli di IL-6 nel gruppo IM erano significativamente più alti che nel gruppo di controllo a 7 e 14 giorni post-infezione (Figura 6B, D-E). Di particolare nota, i livelli di IL-6 erano significativamente più alti nel gruppo IM che nel gruppo IN a 14 giorni post-infezione (p<0,05). L'IL-1β in entrambi i gruppi di animali infetti ha mostrato un andamento crescente, con il gruppo IM che mostrava livelli significativamente più alti rispetto al gruppo di controllo a 3, 7 e 14 dpi, mentre il gruppo IN mostrava una differenza significativa solo a 14 dpi (Figura 6C).
Figura 6. I livelli di IL-12 erano significativamente più alti nel gruppo IM che nel gruppo IN e nel gruppo di controllo a 14 dpi (Figura 6F). L'andamento generale ha mostrato una risposta citochinica proinfiammatoria più forte nel gruppo IM, in particolare nei livelli di IL-6 a 7 e 14 dpi, che era positivamente correlata al tasso di mortalità del 100% nel gruppo IM.
7. Risposte anticorpali specifiche e neutralizzanti negli animali infettati da PRRSV-1 Lleida 029_22
Gli anticorpi specifici per PRRSV-1 e PRRSV-2 sono stati valutati utilizzando kit ELISA commerciali (Figura 7A). La sieroconversione si è verificata nel 70% degli animali nel gruppo IM e nel 90% degli animali nel gruppo IN a 14 dpi. Il rapporto S/P in entrambi i gruppi era significativamente più alto di quello nel gruppo di controllo (p < 0,05). I livelli di anticorpi nel gruppo IN hanno iniziato a diminuire a 21 dpi, sono rimasti stabili a 42 dpi, sono rimbalzati a 56 dpi e poi sono diminuiti leggermente a 63 dpi. Il gruppo di controllo è rimasto sieronegativo durante l'esperimento (S/P < 0,4).
Figura 7. I test sugli anticorpi neutralizzanti hanno mostrato che nel gruppo IN, solo un basso titolo di 2 log₂ è stato rilevato a 28 dpi, che poi è gradualmente aumentato a 3,71 log₂ a 56 dpi (Figura 7B). I titoli anticorpali variavano tra gli individui nello stesso momento e la comparsa di anticorpi neutralizzanti coincideva con la clearance del virus infettivo dal siero dopo 28 dpi (Figura 4B). Nessun anticorpo neutralizzante è stato rilevato nel gruppo di controllo.
8. Rilevamento e isolamento di PRRSV-1 Lleida 029_22 negli omogenati tissutali
La RT-qPCR è stata utilizzata per misurare i carichi virali in vari tessuti (Figura 4F). Nel gruppo IM, i carichi virali erano relativamente coerenti tra i tessuti, con i carichi più alti nei polmoni, nei linfonodi mediastinici e nella milza. Nel gruppo IN, i carichi virali variavano in modo significativo tra i tessuti, con i carichi più alti nelle tonsille e nei linfonodi mediastinici. Come previsto, il carico virale complessivo nel gruppo IN era inferiore a quello nel gruppo IM, il che potrebbe essere correlato al diverso momento della necroscopia. La significativa variabilità dei carichi tissutali negli animali infetti nel gruppo IN era anche associata a diversi momenti della morte (campioni ombreggiati a 12, 21 e 43 dpi rispetto a 63 dpi). Nessun RNA virale è stato rilevato in alcun campione di tessuto del gruppo di controllo.
Tabella 1. I tessuti prelevati da animali deceduti a 12, 21 o 43 giorni post-infezione sono risultati positivi per aVI.
(Nota della tabella: la tabella 1 riassume i risultati della RT-qPCR e dell'isolamento del virus dai campioni di tessuto. "MLN" indica i linfonodi mediastinici e "ILN" indica i linfonodi inguinali.)
9. Analisi patologica e immunoistochimica dei tessuti infettati da PRRSV
Risultati della necroscopia: Gli animali deceduti dopo l'infezione da PRRSV (in particolare quelli deceduti tra 12 e 21 giorni post-infezione) hanno mostrato lesioni sistemiche significative, tra cui cute purpurica, edema generalizzato, grave linfoadenopatia, splenomegalia (a volte con iperplasia follicolare) ed emorragia gastrica. Le lesioni polmonari erano prominenti, dimostrando collasso parziale, consolidamento multifocale e macule rosso-brunastre, coerenti con la polmonite interstiziale, con lesioni più gravi negli animali deceduti precocemente (Figura 8A). Circa il 20% degli animali con infezione intranasale ha sviluppato anche ascessi, pericardite e artrite causati da infezione batterica secondaria. Nessuna lesione macroscopica è stata osservata negli animali di controllo.
Figura 8. L'analisi istopatologica ha mostrato che i punteggi della polmonite interstiziale negli animali deceduti precocemente (12-21 dpi) nei gruppi IM e IN variavano da 1,83 a 3,33 punti. Tuttavia, questi punteggi sono stati significativamente ridotti negli animali sacrificati a 63 dpi (gruppo di controllo, 0,17-0,83 punti; gruppo IN, 0,50-1,17 punti). Di particolare nota, il punteggio istologico delle tonsille nel gruppo IN era significativamente più alto di quello nel gruppo di controllo a 63 dpi (p<0,05), ma non sono state osservate differenze significative in altri tessuti (Figura 8C).
(Didascalia: la Figura 8B mostra i punteggi istopatologici e la Figura 8C confronta i punteggi istologici dei vari gruppi a 63 dpi)
La patologia microscopica ha rivelato polmonite interstiziale (ispessimento della parete alveolare, proliferazione cellulare e infiltrazione di cellule infiammatorie) nei polmoni di tutti gli animali infetti. Essudati e tessuto necrotico erano presenti all'interno degli alveoli, insieme a segni di danno vascolare. Il tessuto linfoide (linfonodi e milza) mostrava grave linfopenia e necrosi, accompagnate da danno vascolare (ad esempio, trombosi e vasculite). Infiltrazione di cellule infiammatorie perivascolari, edema e gliosi sono stati osservati nella sostanza bianca del cervello (Figura 9A).
L'analisi immunoistochimica (IHC) ha rilevato antigeni PRRSV nei macrofagi e, occasionalmente, nei pneumociti di tipo II, dai polmoni, dai linfonodi, dalle tonsille e dalle milze degli animali infetti (Figura 9B). Gli antigeni virali sono stati rilevati anche nelle cellule infiammatorie perivascolari nel cervello.
Figura 9. L'infezione da PRRSV causa estesi danni patologici nei polmoni, nei tessuti linfoidi e nel cervello, localizzati principalmente all'interno dei macrofagi, che mostrano caratteristiche patologiche sistemiche.
Discussione
PRRSV ha un tropismo limitato per le linee cellulari monocitiche ed è stato tradizionalmente isolato e coltivato utilizzando macrofagi alveolari (PAM) e cellule MARC-145. Tuttavia, i PAM sono difficili da ottenere e hanno una grande variabilità da lotto a lotto e i ceppi altamente patogeni sono difficili da adattare a MARC-145. In questo studio, abbiamo utilizzato la linea cellulare immortalata PAM-KNU, che è sensibile a determinati ceppi da campo, invece dei PAM. Abbiamo isolato con successo il ceppo Lleida 029_22, la cui curva di crescita era simile a quella osservata nei PAM. Attualmente, non esiste una linea cellulare universale adatta a tutti i ceppi PRRSV e sono necessari ulteriori sforzi per identificare linee cellulari più adatte per l'isolamento di diversi ceppi.
Conclusione
Questo studio ha stabilito con successo un modello di infezione intranasale con un ceppo PRRSV-1 altamente virulento. Le manifestazioni cliniche (alta mortalità, sintomi gravi, febbre alta persistente e viremia) assomigliano molto a quelle osservate nelle epidemie sul campo. Il risultato chiave è stato che la via di infezione ha influenzato in modo significativo l'esito: l'infezione intramuscolare (IM) ha determinato una mortalità acuta del 100%, mentre l'infezione intranasale (IN) ha avuto un tasso di mortalità solo del 30% e i suini infetti alla fine si sono completamente ripresi. Questa significativa differenza evidenzia il rischio che le pratiche di iniezione IM in azienda potrebbero aggravare in modo significativo la gravità dell'epidemia attraverso la trasmissione nosocomiale.
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