El síndrome reproductivo y respiratorio porcino sigue siendo una de las enfermedades infecciosas más importantes que afectan a la industria porcina mundial.La reciente aparición de una cepa de PRRSV-1 altamente patógena en el noreste de España (detectada por primera vez en 2020) ha planteado nuevos desafíos para el control de la enfermedadAunque estas cepas virulentas son devastadoras en el campo, su caracterización experimental completa aún no se ha investigado completamente.Este estudio investigó sistemáticamente los orígenes genéticos, las características de replicación in vitro y los mecanismos de patogenicidad de la cepa española de PRRSV-1 altamente patógena, Lleida 029_22, que ha surgido recientemente,a través de dos vías de infección (intramuscular e intranasal).
Un estudio reciente publicado en Wiley Online Library analizó las características genéticas y la patogenicidad de la cepa de PRRSV-1 altamente patógena Lleida 029_22 en cerdos.El análisis filogenético reveló que la cepa Lleida 029_22 pertenece a un nuevo clado asociado con el brote de PRRSV-1 Rosalia y es homóloga a la cepa italiana de alta patogenicidad PR40Esta cepa se replica eficientemente en los macrófagos alveolares porcinos y en las células PAM-KNU in vitro, pero no en las células MARC-145.
Para evaluar su patogenicidad, los lechones de ocho semanas de edad fueron inoculados con la misma dosis de 2×105 TCID5 de Lleida 029_22 mediante inyecciones intramusculares (IM) e intranasal (IN).La vacunación por vía intravenosa dio lugar a una mortalidad del 100% en 14 días.En contraste, el aumento de las concentraciones de las enzimas inmunitarias en los pacientes con infecciones por virus, que se producen en el cuerpo, se ve acompañado por una alta viremia, un alto flujo viral, niveles significativamente elevados de citocinas proinflamatorias (especialmente IL- 6), y lesiones pulmonares graves.los cerdos vacunados con la vacuna IN tuvieron una menor tasa de mortalidad (30%) y síntomas clínicos moderadosLos supervivientes se recuperaron después de 63 días, pero mostraron viremia y derramamiento prolongados, y bajos niveles de citoquinas proinflamatorias y anticuerpos neutralizantes a partir del día 28.
Curiosamente, IN Infection recapituló fielmente los síntomas clínicos de un brote causado por la cepa de Rosalia altamente virulenta en granjas españolas,Mientras que la infección intravenosa destacó el riesgo de transmisión nosocomial.
Antecedentes: El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) es un patógeno importante que amenaza a la industria porcina mundial.Su alta variabilidad y diversidad hacen que las vacunas existentes sean inconsistentemente eficacesEn 2020, una cepa de PRRSV-1 altamente virulenta llamada "Rosalia" surgió en España y se extendió rápidamente, causando graves pérdidas (por ejemplo, aumento de la mortalidad durante la temporada de crecimiento).El análisis genético sugiere que probablemente surgió de una cepa italiana muy virulentaEsta cepa causa altas tasas de aborto y mortalidad (> 20%) en el campo, pero faltan datos experimentales sistemáticos.
Objetivos y métodos del estudio: Este estudio tuvo como objetivo caracterizar de manera exhaustiva la cepa de PRRSV-1 altamente virulenta aislada del brote de Rosalia mediante experimentos in vitro e in vivo.Los lechones de ocho semanas de edad fueron inoculados tanto por vía intramuscular (IM) como por vía intranasal (IN)., mientras que IN simula la infección natural).
Objetivos de ensayo: documentación detallada de los signos clínicos y la mortalidad; exámenes patológicos brutales, microscópicos e inmunohistoquímicos de cerdos muertos/necropsiados; cargas virales en suero,la saliva, tampones nasales, rectales y tejidos, así como aislamiento del virus, se realizaron para comprender la dinámica viral y la transmisibilidad;las respuestas inmunitarias fueron evaluadas mediante el análisis de los niveles de anticuerpos específicos y neutralizantes del PRRSV, así como los niveles séricos de citoquinas.
Significado clave: Este estudio proporcionará un modelo experimental clave y una base de datos para evaluar la eficacia de las vacunas existentes, desarrollar nuevas vacunas,y comprender mejor la patogénesis de esta cepa altamente virulenta.
Resultados
1Análisis filogenético de las cepas de PRRSV-1 y caracterización de la secuencia de aminoácidos Nsp2
Características genómicas y ubicación filogenética:
La secuenciación profunda (286×) confirmó que el genoma de la cepa PRRSV-1 Lleida 029_22 tiene una longitud de 14,858 nt (Figura 1A), perteneciendo filogenéticamente al linaje del subtipo 1 del PRRSV-1.Esta cepa forma un clado independiente de otras tres cepas asociadas con el brote de Rosalia (Figura 1A), comparte una identidad de nucleótidos del 96,61% al 97,26%, y es homólogo a la cepa PR40 altamente patógena.
Característica de eliminación de Nsp2:
La proteína Nsp2 de la cepa Lleida 029_22 presenta una deleción de 63 aminoácidos (posiciones 317-379 en relación con la cepa Lelystad) (figura 1B).mientras que la eliminación en su cepa homóloga, PR40, es aún más grande (Figura 1A), lo que sugiere que esta variación genética surgió temprano en la evolución del clado.
Figura 1. Árbol filogenético de la cepa PRRSV-1 Lleida 029_22 y alineación de la secuencia Nsp2
(A) Árbol filogenético de máxima probabilidad construido sobre la base de toda la secuencia del genoma (modelo GTR, 1000 pruebas de arranque).
▲: cepa Lleida 029_22 utilizada en este estudio; ●: cepa asociada al brote de Rosalia.
(B) Alineación parcial de la secuencia de aminoácidos Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).
Las cepas comparadas: Lleida 029_22, cepa asociada con el brote de Rosalia, cepa PR40 altamente virulenta y el prototipo de la cepa Lelystad.
*Nota: Nsp2, proteína no estructural 2; PRRSV-1, virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino tipo 1.
2Características de replicación in vitro de la cepa PRRSV-1 Lleida 029_22
En primer lugar, se evaluaron in vitro las características de replicación de la cepa Lleida 029_22 que se replicó de manera eficiente en las células PAM y PAM-KNU, pero no en las células MARC-145 (Figura 2A).Las curvas de crecimiento viral en los tres tipos de células mostraron títulos virales similares en las células PAM y PAM-KNUA las 72 horas, ambos tipos de células alcanzaron títulos virales de aproximadamente 105TCID50/ ml.Las células MARC-145 no fueron capaces de sostener una infección viral eficiente, con títulos virales que caen a niveles indetectables después de 72 horas.
Figura 2. Cinética del crecimiento del PRRSV-1 Lleida 029_22 en tres líneas celulares
(A) Microscopía por fluorescencia 72 horas después de la infección (MOI = 0.1, tinción con anticuerpos de proteínas anti-N; objetivo 20x)
(B) Dinámica de los títulos virales en las células PAM-KNU (media ± SD de tres experimentos independientes)
*Nota: MOI, multiplicidad de infección; PAM, macrófagos alveolares primarios; PRRSV-1, virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino tipo 1.
3Manifestaciones clínicas y mortalidad en cerdos infectados con Lleida 029_22
La patogenicidad del PRRSV-1 Lleida 029_22 se evaluó por vía intramuscular (IM) e intranasal (IN).con una temperatura de más de 41 °C a 7 dpiEl grupo de inoculación intranasal mostró una fiebre más leve, que sólo superó brevemente los 41°C a los 5 días después de la inoculación, seguida de un patrón de fiebre intermitente.El grupo de control no mostró temperaturas corporales anormales durante todo el experimento (Figura 3A)..
Las observaciones clínicas revelaron que el grupo infectado con IM experimentó dificultad respiratoria aguda, síntomas neurológicos, disnea severa y cianosis de las orejas y el escroto,En el grupo infectado con IN se presentó principalmente una infección moderada.Los signos clínicos adicionales incluyeron pelaje despedazado, edema (más pronunciado en las extremidades y el cuello), inflamación articular y deterioro general de la condición corporal en ambos grupos.pero estos fueron más graves en el grupo IMEstas manifestaciones clínicas graves se concentraron principalmente entre los 12 y 14 días posteriores a la vacunación, coincidiendo con el período de alta mortalidad o eutanasia por razones de bienestar.
En general, las puntuaciones clínicas en el grupo infectado con IM fueron significativamente más altas que en el grupo infectado con IN a los 11, 12 y 14 días después de la inoculación (p < 0,05),máximo a los 14 días después de la vacunación (Figura 3B)Las puntuaciones clínicas en el grupo IN fueron más bajas, alcanzando su punto máximo a los 13 días después de la infección (dpi).pero los puntajes se mantuvieron significativamente más altos que los del grupo control (p < 0).No se observaron síntomas clínicos en el grupo control durante todo el experimento (Figura 3B).
Linear mixed model analysis (accounting for the non-independence of observations from the same animal at different time points) revealed that group- and day-specific variables significantly influenced body temperature and clinical scores during the first 14 days (p < 0.05) Se observaron diferencias significativas entre los grupos de IM e IN, así como entre los dos grupos de infección y el grupo de control.
El análisis de supervivencia mostró que todos los animales del grupo de infección por IM murieron antes de los 14 días posteriores a la infección, con una tasa de mortalidad del 100%.Las muertes naturales o inducidas se concentraron entre los 12 y 14 días posteriores a la infección.En el grupo de infección IN, la mortalidad fue del 30% a los 63 días después de la infección, y las muertes ocurrieron a los 12, 21 y 43 días después de la infección.Todos los animales del grupo de control sobrevivieron hasta el final del experimento (Figura 3C).
Figura 3. Resultados clínicos en cerdos infectados con PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) Temperaturas rectales diarias después de la infección (línea de puntos rojos: umbral de fiebre > 41 °C; media ± SD)
(B) Puntuación clínica media diaria (media ± SD; letras idénticas no indican diferencias significativas entre los grupos, p < 0,05)
(C) Curvas de supervivencia de los grupos experimentales
Nota: C, grupo control; IM, grupo intramuscular; IN, grupo intranasal.
4Viremia y eliminación viral en animales infectados por PRRSV
Los niveles de viremia después de la infección por PRRSV-1 Lleida 029_22 se evaluaron mediante RT-qPCR.con diferencias significativas entre los grupos IM e IN en comparación con el grupo de control, que se mantuvo negativo (p < 0.05La viremia en el grupo IN alcanzó su punto máximo a los 7 días después de la infección.mientras que las cargas virales en el grupo IM fueron significativamente más altas que en los grupos IN y control a los 7 y 14 días después de la infección (p < 0)..05). Posteriormente, la carga viral en el grupo IN disminuyó gradualmente, pero seguía siendo significativamente superior a la del grupo control, con 28 dpi.
Figura 4. El desprendimiento viral se evaluó con hisopos nasales y nasales/rectales. Todos los animales infectados dieron positivo al virus a 3 dpi en hisopos nasales, nasales y rectales.
El derrame salival continuó hasta los 14 dpi en el grupo IM y hasta el final del experimento en el grupo IN (pico a 3 dpi; Figura 4B).
El derrame nasal alcanzó su punto máximo en 7 dpi en ambos grupos, con cargas virales significativamente más altas en el grupo IM a 7/14 dpi que en el grupo IN (* p<0.05; Figura 4C).
El derrame rectal continuó hasta 14 dpi en el grupo IM y hasta 35 dpi en el grupo IN (con un ligero rebote a 56 dpi), con ambos picos a 7 dpi (Figura 4D).
El análisis del AUC confirmó que las cargas virales en todas las muestras de los grupos infectados eran significativamente más altas que las del grupo control,y que las cargas de hisopos nasales en el grupo IM fueron mayores que las del grupo IN (*p<0.05). En resumen, la eliminación del VRSPR se produce temprano y se mantiene después de la infección.
5Verificación del aislamiento del PRRSV infeccioso de muestras RT-qPCR positivas
Para confirmar la presencia de virus infecciosos en muestras RT-qPCR positivas, se realizaron experimentos de aislamiento del virus (VI) utilizando células PAM-KNU (Figura 5). the success rate of virus isolation was 100% (10/10) for samples collected between 3 and 14 days post-inoculation (dpi) in the IM group and 100% (10/10) for samples collected between 3 and 7 days post-inoculation (dpi) in the IN groupSin embargo, la tasa de éxito disminuyó gradualmente a los 14 días después de la vacunación (70%), 21 días después de la vacunación (55.6%) y 28 días después de la vacunación (12.5%).
Figura 5. Se aislaron con éxito tres cepas de virus infecciosos a partir de muestras de saliva recolectadas de ambos animales infectados a los 3 días después de la infección (dpi) después de dos pasajes de cultivo.No se aislaron virus infecciosos de hisopos nasales o rectales.
6. Respuestas citoquinas inducidas por el PRRSV-1 Lleida 029_22 Infección
Se recogieron muestras de suero durante los primeros 14 días posteriores a la infección para evaluar los niveles de citoquinas, lo que reveló diferencias significativas entre los tres grupos (Figura 6).Los niveles de IFN-α fueron significativamente elevados en ambos grupos de infección a los 3, 7 y 14 días después de la infección (dpi), con niveles de IFN-α significativamente más altos en el grupo IM que en el grupo IN a los 14 días después de la infección (p<0,05).y IL-6 mostraron tendencias similares: IL-1α aumentó en el grupo IN a los 3 días después de la infección y se mantuvo estable,Los niveles de IL-6 en el grupo IM fueron significativamente más altos que en el grupo control a los 7 y 14 días después de la infección (Figura 6B).Cabe destacar que los niveles de IL-6 fueron significativamente más altos en el grupo IM que en el grupo IN a los 14 días después de la infección (p<0,05).La IL-1β en ambos grupos de animales infectados mostró una tendencia creciente., con niveles significativamente más altos que el grupo de control en 3, 7 y 14 dpi, mientras que el grupo IN mostró una diferencia significativa sólo en 14 dpi (gráfico 6C).
Figura 6. Los niveles de IL-12 fueron significativamente más altos en el grupo IM que en el grupo IN y en el grupo control a 14 dpi (Figura 6F).La tendencia general mostró una mayor respuesta proinflamatoria de las citoquinas en el grupo IM.En el grupo de IM, la mortalidad fue de 100%, especialmente en los niveles de IL-6 a 7 y 14 dpi, lo que se correlacionó positivamente con la tasa de mortalidad del 100%.
7. Respuestas específicas y neutralizantes de anticuerpos en animales infectados con PRRSV-1 Lleida 029_22
Los anticuerpos específicos del PRRSV-1 y del PRRSV-2 se evaluaron utilizando kits comerciales de ELISA (Figura 7A).La seroconversión se produjo en el 70% de los animales del grupo IM y en el 90% de los animales del grupo IN a 14 dpi.Los niveles de anticuerpos en el grupo IN comenzaron a disminuir a 21 dpi, se mantuvieron estables a 42 dpi,rebotado a 56 dpiEl grupo control se mantuvo seronegativo durante todo el experimento (S/P < 0,4).
Figura 7. Las pruebas de anticuerpos neutralizantes mostraron que en el grupo IN, solo se detectó un título bajo de 2 log2 a 28 dpi, que luego aumentó gradualmente a 3.71 log2 a 56 dpi (Figura 7B).Los títulos de anticuerpos variaron entre individuos en el mismo momento.No se detectaron anticuerpos neutralizantes en el grupo control..
8Detección y aislamiento del PRRSV-1 Lleida 029_22 en tejidos homogéneos
La RT-qPCR se utilizó para medir las cargas virales en varios tejidos (Figura 4F). En el grupo IM, las cargas virales fueron relativamente consistentes entre los tejidos, con las cargas más altas en los pulmones,los ganglios linfáticos mediastinalesEn el grupo IN, las cargas virales variaron significativamente entre los tejidos, con las cargas más altas en las amígdalas y los ganglios linfáticos mediastinales.la carga viral total en el grupo IN fue inferior a la del grupo IM, lo que puede estar relacionado con la diferencia en el momento de la necropsia.La variabilidad significativa en las cargas de tejido en animales infectados en el grupo IN también se asoció con diferentes tiempos de muerte (muestras grises a los 12 años de edad).No se detectó ARN viral en ninguna muestra de tejido del grupo de control.
Cuadro 1. Los tejidos recolectados de animales que murieron a los 12, 21 o 43 días después de la infección dieron positivo a la AVI.
(Nota de la tabla: la tabla 1 resume los resultados de la RT-qPCR y el aislamiento del virus de muestras de tejido. "MLN" denota los ganglios linfáticos mediastinales y "ILN" denota los ganglios linfáticos inguinales.)
9Análisis patológico e inmunohistoquímico de tejidos infectados por PRRSV
Resultados de la necropsia: los animales que murieron después de la infección por PRRSV (especialmente los que murieron entre los 12 y los 21 días posteriores a la infección) mostraron lesiones sistémicas significativas, incluida la piel púrpura,edema generalizadoLas lesiones pulmonares fueron prominentes, demostrando colapso parcial, consolidación multifocal,y manchas marrones rojizasEn el caso de los animales con infección intranasal, aproximadamente el 20% de los animales también desarrollaron abscesos.PericarditisNo se observaron lesiones graves en los animales de control.
Figura 8. El análisis histopatológico mostró que las puntuaciones de la neumonía intersticial en animales que murieron temprano (12-21 dpi) en los grupos IM e IN oscilaron entre 1,83 y 3,33 puntos.Estas puntuaciones se redujeron significativamente en animales sacrificados a 63 dpi (grupo control).En particular, la puntuación histológica de las amígdalas en el grupo IN fue significativamente superior a la del grupo control a 63 dpi (p<0,05),pero no se observaron diferencias significativas en otros tejidos (Figura 8C).
(Título: la Figura 8B muestra las puntuaciones histopatológicas y la Figura 8C compara las puntuaciones histológicas de los diferentes grupos a 63 dpi)
La patología microscópica reveló neumonía intersticial (engrosamiento de la pared alveolar, proliferación celular e infiltración de células inflamatorias) en los pulmones de todos los animales infectados.Exudados y tejido necrótico estaban presentes dentro de los alvéolos.El tejido linfoide ( ganglios linfáticos y bazo) mostró linfopenia y necrosis graves, acompañadas de daño vascular (por ejemplo, trombosis y vasculitis).Infiltración de células inflamatorias perivascularesEn el cerebro, se observaron edema y gliosis en la sustancia blanca (Figura 9A).
El análisis inmunohistoquímico (IHC) detectó antígenos del PRRSV en macrófagos y, ocasionalmente, en neumócitos tipo II, de los pulmones, ganglios linfáticos, amígdalas y bazo de animales infectados (Figura 9B).También se detectaron antígenos virales en células inflamatorias perivasculares del cerebro..
Figura 9. La infección por PRRSV causa daños patológicos extensos en los pulmones, los tejidos linfoides y el cerebro, principalmente localizados dentro de los macrófagos, que presentan características patológicas sistémicas.
El debate
El PRRSV tiene un tropismo restringido para las líneas celulares monocíticas y tradicionalmente se ha aislado y cultivado utilizando macrófagos alveolares (PAM) y células MARC-145.Los PAM son difíciles de obtener y presentan una gran variabilidad de lote a lote.En este estudio, utilizamos la línea celular inmortalizada PAM-KNU, que es sensible a ciertas cepas de campo, en lugar de PAMs.Hemos aislado con éxito la cepa Lleida 029_22, cuya curva de crecimiento fue similar a la observada en los PAM.y se necesitan esfuerzos futuros para identificar líneas celulares más adecuadas para el aislamiento de diversas cepas.
Conclusión
Este estudio estableció con éxito un modelo de infección intranasal con una cepa de PRRSV-1 altamente virulenta.y viremia) se parecen mucho a los observados en los brotes de campo.El hallazgo clave fue que la vía de infección influyó significativamente en el resultado: la infección intramuscular (IM) dio lugar a una mortalidad aguda del 100%.Mientras que la infección intranasal (IN) tenía una tasa de mortalidad de sólo el 30%, y los cerdos infectados finalmente se recuperaron por completo.Esta diferencia significativa pone de manifiesto el riesgo de que las prácticas de inyección IM en granjas puedan exacerbar significativamente la gravedad de la epidemia a través de la transmisión nosocomial..
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