Le syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SRRP) reste l'une des maladies infectieuses les plus importantes affectant l'industrie porcine mondiale. L'émergence récente d'une souche PRRSV-1 hautement pathogène dans le nord-est de l'Espagne (détectée pour la première fois en 2020) a présenté de nouveaux défis pour le contrôle de la maladie. Bien que ces souches virulentes soient dévastatrices sur le terrain, leur caractérisation expérimentale complète n'a pas encore été entièrement étudiée. Par conséquent, cette étude a systématiquement étudié les origines génétiques, les caractéristiques de réplication in vitro et les mécanismes de pathogénicité de la nouvelle souche espagnole PRRSV-1 hautement pathogène, Lleida 029_22, via deux voies d'infection (intramusculaire et intranasale).
Une étude récente publiée dans Wiley Online Library a analysé les caractéristiques génétiques et la pathogénicité de la souche PRRSV-1 hautement pathogène Lleida 029_22 chez les porcs. L'analyse phylogénétique a révélé que la souche Lleida 029_22 appartient à un nouveau clade associé à l'épidémie de PRRSV-1 Rosalia et est homologue à la souche italienne hautement pathogène PR40. Cette souche se réplique efficacement dans les macrophages alvéolaires porcins et les cellules PAM-KNU in vitro, mais pas dans les cellules MARC-145.
Pour évaluer sa pathogénicité, des porcelets âgés de huit semaines ont été inoculés avec la même dose de 2×10⁵ TCID⁵ de Lleida 029_22 par injections intramusculaires (IM) et intranasales (IN). L'inoculation IM a entraîné une mortalité de 100 % en 14 jours, accompagnée d'une virémie élevée, d'une excrétion virale élevée, de niveaux significativement élevés de cytokines pro-inflammatoires (en particulier IL-6) et de lésions pulmonaires graves. En revanche, les porcs vaccinés avec le vaccin IN ont présenté un taux de mortalité plus faible (30 %) et des signes cliniques modérés. Les survivants se sont rétablis après 63 jours, mais ont présenté une virémie et une excrétion prolongées, ainsi que de faibles niveaux de cytokines pro-inflammatoires et d'anticorps neutralisants à partir du jour 28.
Il est intéressant de noter que l'infection IN a fidèlement reproduit les symptômes cliniques d'une épidémie causée par la souche Rosalia hautement virulente dans les élevages espagnols, tandis que l'infection IM a mis en évidence le risque de transmission nosocomiale.
Contexte : Le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (PRRSV) est un agent pathogène majeur menaçant l'industrie porcine mondiale. Sa forte variabilité et sa diversité rendent les vaccins existants inégalement efficaces. En 2020, une souche PRRSV-1 hautement virulente nommée "Rosalia" est apparue en Espagne et s'est propagée rapidement, causant de graves pertes (par exemple, une augmentation de la mortalité pendant la saison de croissance). L'analyse génétique suggère qu'elle est probablement issue d'une souche italienne hautement virulente, PR40, par recombinaison. Cette souche provoque des taux élevés d'avortement et de mortalité (>20 %) sur le terrain, mais les données expérimentales systématiques font défaut.
Objectifs et méthodes de l'étude : Cette étude visait à caractériser de manière exhaustive la souche PRRSV-1 hautement virulente isolée de l'épidémie de Rosalia en utilisant des expériences in vitro et in vivo. Des porcelets âgés de huit semaines ont été inoculés par les voies d'infection intramusculaire (IM) et intranasale (IN) (IM est la voie expérimentale couramment utilisée, tandis que IN simule l'infection naturelle).
Objectifs des tests : Documentation détaillée des signes cliniques et de la mortalité ; examens pathologiques macroscopiques, microscopiques et immunohistochimiques des porcs décédés/nécropsiés ; les charges virales dans le sérum, la salive, les écouvillons nasaux, les écouvillons rectaux et les tissus, ainsi que l'isolement du virus, ont été effectués pour comprendre la dynamique virale et la transmissibilité ; et les réponses immunitaires ont été évaluées en analysant les niveaux d'anticorps spécifiques et neutralisants du PRRSV, ainsi que les niveaux de cytokines sériques.
Importance clé : Cette étude fournira un modèle expérimental clé et une base de données pour évaluer l'efficacité des vaccins existants, développer de nouveaux vaccins et mieux comprendre la pathogenèse de cette souche hautement virulente.
Résultats
1. Analyse phylogénétique des souches PRRSV-1 et caractérisation de la séquence des acides aminés de Nsp2
Caractéristiques génomiques et positionnement phylogénétique :
Le séquençage profond (286×) a confirmé que le génome de la souche PRRSV-1 Lleida 029_22 mesure 14 858 nt de long (Figure 1A), appartenant phylogénétiquement au lignage du sous-type 1 du PRRSV-1. Cette souche forme un clade indépendant des trois autres souches associées à l'épidémie de Rosalia (Figure 1A), partageant une identité nucléotidique de 96,61 % à 97,26 %, et est homologue à la souche PR40 hautement pathogène.
Caractérisation de la délétion de Nsp2 :
La protéine Nsp2 de la souche Lleida 029_22 présente une délétion de 63 acides aminés (positions 317-379 par rapport à la souche Lelystad) (Figure 1B). Cette délétion est conservée au sein du clade Rosalia, tandis que la délétion dans sa souche homologue, PR40, est encore plus importante (Figure 1A), ce qui suggère que cette variation génétique est apparue tôt dans l'évolution du clade.
Figure 1. Arbre phylogénétique de la souche PRRSV-1 Lleida 029_22 et alignement de la séquence Nsp2
(A) Arbre phylogénétique de vraisemblance maximale construit sur la base de la séquence complète du génome (modèle GTR, 1000 tests bootstrap).
▲ : Souche Lleida 029_22 utilisée dans cette étude ; ● : Souche associée à l'épidémie de Rosalia.
(B) Alignement partiel de la séquence des acides aminés de Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).
Souches comparées : Lleida 029_22, souche associée à l'épidémie de Rosalia, souche PR40 hautement virulente et souche prototype Lelystad.
*Remarque : Nsp2, protéine non structurale 2 ; PRRSV-1, virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin de type 1.
2. Caractéristiques de réplication in vitro de la souche PRRSV-1 Lleida 029_22
Tout d'abord, les caractéristiques de réplication de la souche Lleida 029_22 ont été évaluées in vitro. Cette souche s'est répliquée efficacement dans les PAM et les cellules PAM-KNU, mais pas dans les cellules MARC-145 (Figure 2A). Les courbes de croissance virale dans les trois types de cellules ont montré des titres viraux similaires dans les PAM et les cellules PAM-KNU, bien que ces dernières aient présenté des titres légèrement inférieurs (Figure 2B). À 72 heures, les deux types de cellules ont atteint des titres viraux d'environ 10⁵TCID₅₀/mL. En revanche, les cellules MARC-145 n'ont pas pu maintenir une infection virale efficace, les titres viraux tombant à des niveaux indétectables après 72 heures.
Figure 2. Cinétique de croissance du PRRSV-1 Lleida 029_22 dans trois lignées cellulaires
(A) Microscopie à fluorescence 72 heures après l'infection (MOI = 0,1, coloration avec un anticorps anti-protéine N ; objectif 20x)
(B) Dynamique des titres viraux dans les cellules PAM-KNU (moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes)
*Remarque : MOI, multiplicité d'infection ; PAM, macrophages alvéolaires primaires ; PRRSV-1, virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin de type 1.
3. Manifestations cliniques et mortalité chez les porcs infectés par Lleida 029_22
La pathogénicité du PRRSV-1 Lleida 029_22 a été évaluée par les voies d'inoculation intramusculaire (IM) et intranasale (IN). Les porcs du groupe IM ont montré une augmentation de la température corporelle à partir de 1 jour post-inoculation (dpi), dépassant 41°C à 7 dpi, et persistant jusqu'à 13 dpi. Le groupe d'inoculation intranasale a présenté une fièvre plus légère, dépassant brièvement 41°C à 5 jours post-inoculation, suivie d'un schéma de fièvre intermittent. Le groupe témoin n'a présenté aucune température corporelle anormale tout au long de l'expérience (Figure 3A).
Les observations cliniques ont révélé que le groupe infecté par IM a présenté une détresse respiratoire aiguë, des symptômes neurologiques, une dyspnée sévère et une cyanose des oreilles et du scrotum, tandis que le groupe infecté par IN a principalement présenté une dyspnée modérée et persistante. Les signes cliniques supplémentaires comprenaient un pelage en lambeaux, un œdème (plus prononcé sur les membres et le cou), une inflammation des articulations et une détérioration globale de l'état corporel dans les deux groupes, mais ceux-ci étaient plus graves dans le groupe IM. Ces manifestations cliniques graves étaient principalement concentrées entre 12 et 14 jours post-inoculation, coïncidant avec la période de forte mortalité ou d'euthanasie pour des raisons de bien-être.
Dans l'ensemble, les scores cliniques dans le groupe infecté par IM étaient significativement plus élevés que ceux du groupe infecté par IN à 11, 12 et 14 jours post-inoculation (p < 0,05), atteignant un pic à 14 jours post-inoculation (Figure 3B). Les scores cliniques dans le groupe IN étaient plus faibles, atteignant leur pic à 13 jours post-infection (dpi). Les symptômes se sont progressivement atténués par la suite, mais les scores sont restés significativement plus élevés que ceux du groupe témoin (p < 0,05). Aucun symptôme clinique n'a été observé dans le groupe témoin tout au long de l'expérience (Figure 3B).
L'analyse du modèle mixte linéaire (tenant compte de la non-indépendance des observations provenant du même animal à différents moments) a révélé que les variables spécifiques au groupe et au jour ont influencé de manière significative la température corporelle et les scores cliniques au cours des 14 premiers jours (p < 0,05). Des différences significatives ont été constatées entre les groupes IM et IN, ainsi qu'entre les deux groupes d'infection et le groupe témoin.
L'analyse de la survie a montré que tous les animaux du groupe d'infection IM sont morts avant 14 jours post-infection, avec un taux de mortalité de 100 %. Les décès naturels ou induits étaient concentrés entre 12 et 14 jours post-infection. Dans le groupe d'infection IN, la mortalité était de 30 % à 63 jours post-infection, les décès survenant à 12, 21 et 43 jours post-infection. Tous les animaux du groupe témoin ont survécu jusqu'à la fin de l'expérience (Figure 3C).
Figure 3. Résultats cliniques chez les porcs infectés par PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) Températures rectales quotidiennes post-infection (ligne pointillée rouge : seuil de fièvre >41°C ; moyenne ± écart type)
(B) Score clinique moyen quotidien (moyenne ± écart type ; des lettres identiques indiquent l'absence de différences significatives entre les groupes, p < 0,05)
(C) Courbes de survie des groupes expérimentaux
Remarque : C, groupe témoin ; IM, groupe intramusculaire ; IN, groupe intranasal.
4. Virémie et excrétion virale chez les animaux infectés par le PRRSV
Les niveaux de virémie après l'infection par le PRRSV-1 Lleida 029_22 ont été évalués par RT-qPCR. L'ARN du PRRSV a été détecté dans le sérum de tous les animaux infectés à 3 jours post-infection, avec des différences significatives entre les groupes IM et IN par rapport au groupe témoin, qui est resté négatif (p < 0,05 ; Figure 4A). La virémie dans le groupe IN a atteint un pic à 7 jours post-infection, tandis que les charges virales dans le groupe IM étaient significativement plus élevées que celles des groupes IN et témoins à la fois à 7 et 14 jours post-infection (p < 0,05). Par la suite, la charge virale dans le groupe IN a progressivement diminué, mais était toujours significativement plus élevée que celle du groupe témoin à 28 dpi.
Figure 4. L'excrétion virale a été évaluée par des écouvillons de salive et nasaux/rectaux. Tous les animaux infectés ont été testés positifs pour le virus à 3 dpi dans les écouvillons de salive, nasaux et rectaux.
L'excrétion salivaire s'est poursuivie jusqu'à 14 dpi dans le groupe IM et jusqu'à la fin de l'expérience dans le groupe IN (pic à 3 dpi ; Figure 4B).
L'excrétion nasale a atteint un pic à 7 dpi dans les deux groupes, avec des charges virales significativement plus élevées dans le groupe IM à 7/14 dpi que dans le groupe IN (*p<0,05 ; Figure 4C).
L'excrétion rectale s'est poursuivie jusqu'à 14 dpi dans le groupe IM et jusqu'à 35 dpi dans le groupe IN (avec un léger rebond à 56 dpi), avec les deux pics à 7 dpi (Figure 4D).
L'analyse AUC a confirmé que les charges virales dans tous les échantillons des groupes infectés étaient significativement plus élevées que celles du groupe témoin, et que les charges des écouvillons nasaux dans le groupe IM étaient plus élevées que celles du groupe IN (*p<0,05). En résumé, l'excrétion du PRRSV se produit tôt et est maintenue après l'infection.
5. Vérification de l'isolement du PRRSV infectieux à partir d'échantillons positifs par RT-qPCR
Pour confirmer la présence de virus infectieux dans les échantillons positifs par RT-qPCR, des expériences d'isolement du virus (VI) ont été réalisées en utilisant des cellules PAM-KNU (Figure 5). Pour les échantillons de sérum, le taux de réussite de l'isolement du virus était de 100 % (10/10) pour les échantillons prélevés entre 3 et 14 jours post-inoculation (dpi) dans le groupe IM et de 100 % (10/10) pour les échantillons prélevés entre 3 et 7 jours post-inoculation (dpi) dans le groupe IN. Cependant, le taux de réussite a progressivement diminué à 14 jours post-inoculation (70 %), 21 jours post-inoculation (55,6 %) et 28 jours post-inoculation (12,5 %).
Figure 5. Trois souches virales infectieuses ont été isolées avec succès à partir d'échantillons de salive prélevés sur les deux animaux infectés à 3 jours post-infection (dpi) après deux passages de culture. Aucun virus infectieux n'a été isolé à partir d'écouvillons nasaux ou rectaux.
6. Réponses des cytokines induites par l'infection par le PRRSV-1 Lleida 029_22
Des échantillons de sérum ont été prélevés au cours des 14 premiers jours post-infection pour évaluer les niveaux de cytokines, révélant des différences significatives entre les trois groupes (Figure 6). Les niveaux d'IFN-α étaient significativement élevés dans les deux groupes d'infection à 3, 7 et 14 jours post-infection (dpi), les niveaux d'IFN-α dans le groupe IM étant significativement plus élevés que dans le groupe IN à 14 jours post-infection (p<0,05). Les cytokines pro-inflammatoires IL-1α, IL-12 et IL-6 ont montré des tendances similaires : l'IL-1α a augmenté dans le groupe IN à 3 jours post-infection et est restée stable, tandis que les niveaux d'IL-6 dans le groupe IM étaient significativement plus élevés que dans le groupe témoin à 7 et 14 jours post-infection (Figure 6B, D-E). Il est particulièrement important de noter que les niveaux d'IL-6 étaient significativement plus élevés dans le groupe IM que dans le groupe IN à 14 jours post-infection (p<0,05). L'IL-1β dans les deux groupes d'animaux infectés a montré une tendance à l'augmentation, le groupe IM montrant des niveaux significativement plus élevés que le groupe témoin à 3, 7 et 14 dpi, tandis que le groupe IN a montré une différence significative uniquement à 14 dpi (Figure 6C).
Figure 6. Les niveaux d'IL-12 étaient significativement plus élevés dans le groupe IM que dans le groupe IN et le groupe témoin à 14 dpi (Figure 6F). La tendance générale a montré une réponse des cytokines pro-inflammatoires plus forte dans le groupe IM, en particulier dans les niveaux d'IL-6 à 7 et 14 dpi, qui était positivement corrélée au taux de mortalité de 100 % dans le groupe IM.
7. Réponses spécifiques et neutralisantes des anticorps chez les animaux infectés par le PRRSV-1 Lleida 029_22
Les anticorps spécifiques du PRRSV-1 et du PRRSV-2 ont été évalués à l'aide de kits ELISA commerciaux (Figure 7A). La séroconversion est survenue chez 70 % des animaux du groupe IM et chez 90 % des animaux du groupe IN à 14 dpi. Le rapport S/P dans les deux groupes était significativement plus élevé que celui du groupe témoin (p < 0,05). Les niveaux d'anticorps dans le groupe IN ont commencé à diminuer à 21 dpi, sont restés stables à 42 dpi, ont rebondi à 56 dpi, puis ont légèrement diminué à 63 dpi. Le groupe témoin est resté séronégatif tout au long de l'expérience (S/P < 0,4).
Figure 7. Les tests d'anticorps neutralisants ont montré que dans le groupe IN, seul un faible titre de 2 log₂ a été détecté à 28 dpi, qui a ensuite progressivement augmenté à 3,71 log₂ à 56 dpi (Figure 7B). Les titres d'anticorps variaient d'un individu à l'autre au même moment, et l'apparition d'anticorps neutralisants coïncidait avec la clairance du virus infectieux du sérum après 28 dpi (Figure 4B). Aucun anticorps neutralisant n'a été détecté dans le groupe témoin.
8. Détection et isolement du PRRSV-1 Lleida 029_22 dans les homogénats tissulaires
La RT-qPCR a été utilisée pour mesurer les charges virales dans divers tissus (Figure 4F). Dans le groupe IM, les charges virales étaient relativement cohérentes dans tous les tissus, avec les charges les plus élevées dans les poumons, les ganglions lymphatiques médiastinaux et la rate. Dans le groupe IN, les charges virales variaient considérablement d'un tissu à l'autre, avec les charges les plus élevées dans les amygdales et les ganglions lymphatiques médiastinaux. Comme prévu, la charge virale globale dans le groupe IN était inférieure à celle du groupe IM, ce qui peut être lié aux différents moments de la nécropsie. La variabilité significative des charges tissulaires chez les animaux infectés dans le groupe IN était également associée à différents moments de décès (échantillons grisés à 12, 21 et 43 dpi par rapport à 63 dpi). Aucun ARN viral n'a été détecté dans aucun échantillon de tissu du groupe témoin.
Tableau 1. Les tissus prélevés sur les animaux décédés à 12, 21 ou 43 jours post-infection ont été testés positifs pour aVI.
(Note du tableau : Le tableau 1 résume les résultats de la RT-qPCR et de l'isolement du virus à partir d'échantillons de tissus. "MLN" désigne les ganglions lymphatiques médiastinaux et "ILN" désigne les ganglions lymphatiques inguinaux.)
9. Analyse pathologique et immunohistochimique des tissus infectés par le PRRSV
Résultats de la nécropsie : Les animaux décédés après une infection par le PRRSV (en particulier ceux décédés entre 12 et 21 jours post-infection) ont présenté des lésions systémiques importantes, notamment une peau purpurique, un œdème généralisé, une lymphadénopathie sévère, une splénomégalie (parfois avec une hyperplasie folliculaire) et une hémorragie gastrique. Les lésions pulmonaires étaient importantes, démontrant un affaissement partiel, une consolidation multifocale et des macules brun rougeâtre, compatibles avec une pneumonie interstitielle, avec des lésions plus graves chez les animaux décédés précocement (Figure 8A). Environ 20 % des animaux infectés par voie intranasale ont également développé des abcès, une péricardite et une arthrite causées par une infection bactérienne secondaire. Aucune lésion macroscopique n'a été observée chez les animaux témoins.
Figure 8. L'analyse histopathologique a montré que les scores de pneumonie interstitielle chez les animaux décédés précocement (12-21 dpi) dans les groupes IM et IN variaient de 1,83 à 3,33 points. Cependant, ces scores ont été significativement réduits chez les animaux sacrifiés à 63 dpi (groupe témoin, 0,17-0,83 points ; groupe IN, 0,50-1,17 points). Il est particulièrement important de noter que le score histologique des amygdales dans le groupe IN était significativement plus élevé que celui du groupe témoin à 63 dpi (p<0,05), mais aucune différence significative n'a été observée dans les autres tissus (Figure 8C).
(Légende : La figure 8B montre les scores histopathologiques, et la figure 8C compare les scores histologiques des différents groupes à 63 dpi)
La pathologie microscopique a révélé une pneumonie interstitielle (épaississement de la paroi alvéolaire, prolifération cellulaire et infiltration de cellules inflammatoires) dans les poumons de tous les animaux infectés. Des exsudats et des tissus nécrotiques étaient présents dans les alvéoles, ainsi que des signes de lésions vasculaires. Les tissus lymphoïdes (ganglions lymphatiques et rate) ont montré une lymphopénie et une nécrose sévères, accompagnées de lésions vasculaires (par exemple, thrombose et vascularite). Une infiltration de cellules inflammatoires périvasculaires, un œdème et une gliose ont été observés dans la substance blanche du cerveau (Figure 9A).
L'analyse immunohistochimique (IHC) a détecté des antigènes PRRSV dans les macrophages, et occasionnellement dans les pneumocytes de type II, des poumons, des ganglions lymphatiques, des amygdales et de la rate des animaux infectés (Figure 9B). Des antigènes viraux ont également été détectés dans les cellules inflammatoires périvasculaires du cerveau.
Figure 9. L'infection par le PRRSV provoque des dommages pathologiques importants dans les poumons, les tissus lymphoïdes et le cerveau, principalement localisés dans les macrophages, présentant des caractéristiques pathologiques systémiques.
Discussion
Le PRRSV a un tropisme limité pour les lignées cellulaires monocytaires et a traditionnellement été isolé et cultivé en utilisant des macrophages alvéolaires (PAM) et des cellules MARC-145. Cependant, les PAM sont difficiles à obtenir et présentent une grande variabilité d'un lot à l'autre, et les souches hautement pathogènes sont difficiles à adapter aux MARC-145. Dans cette étude, nous avons utilisé la lignée cellulaire immortalisée PAM-KNU, qui est sensible à certaines souches de terrain, au lieu des PAM. Nous avons réussi à isoler la souche Lleida 029_22, dont la courbe de croissance était similaire à celle observée dans les PAM. Actuellement, il n'existe pas de lignée cellulaire universelle adaptée à toutes les souches de PRRSV, et des efforts futurs sont nécessaires pour identifier des lignées cellulaires plus appropriées pour l'isolement de diverses souches.
Conclusion
Cette étude a permis d'établir avec succès un modèle d'infection intranasale avec une souche PRRSV-1 hautement virulente. Les manifestations cliniques (mortalité élevée, symptômes graves, fièvre persistante élevée et virémie) ressemblent étroitement à celles observées lors des épidémies sur le terrain. La principale constatation a été que la voie d'infection a considérablement affecté l'issue : l'infection intramusculaire (IM) a entraîné une mortalité aiguë de 100 %, tandis que l'infection intranasale (IN) n'a présenté qu'un taux de mortalité de 30 %, et les porcs infectés se sont finalement complètement rétablis. Cette différence significative met en évidence le risque que les pratiques d'injection IM en élevage pourraient aggraver considérablement la gravité de l'épidémie par transmission nosocomiale.
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