A síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRS) continua sendo uma das doenças infecciosas mais importantes que afetam a indústria suína global. O recente surgimento de uma cepa PRRSV-1 altamente patogênica no nordeste da Espanha (detectada pela primeira vez em 2020) apresentou novos desafios para o controle da doença. Embora essas cepas virulentas sejam devastadoras no campo, sua caracterização experimental abrangente ainda não foi totalmente investigada. Portanto, este estudo investigou sistematicamente as origens genéticas, as características de replicação in vitro e os mecanismos de patogenicidade da nova cepa PRRSV-1 espanhola altamente patogênica, Lleida 029_22, por meio de duas vias de infecção (intramuscular e intranasal).
Um estudo recente publicado na Wiley Online Library analisou as características genéticas e a patogenicidade da cepa PRRSV-1 altamente patogênica Lleida 029_22 em porcos. A análise filogenética revelou que a cepa Lleida 029_22 pertence a um novo clado associado ao surto de PRRSV-1 Rosalia e é homóloga à cepa italiana altamente patogênica PR40. Essa cepa se replica eficientemente em macrófagos alveolares suínos e células PAM-KNU in vitro, mas não em células MARC-145.
Para avaliar sua patogenicidade, leitões de oito semanas de idade foram inoculados com a mesma dose de 2×10⁵ TCID⁵ de Lleida 029_22 por meio de injeções intramusculares (IM) e intranasais (IN). A inoculação IM resultou em 100% de mortalidade em 14 dias, acompanhada de alta viremia, alta eliminação viral, níveis significativamente elevados de citocinas pró-inflamatórias (particularmente IL-6) e lesões pulmonares graves. Em contraste, os porcos vacinados com a vacina IN tiveram uma taxa de mortalidade menor (30%) e sinais clínicos moderados. Os sobreviventes se recuperaram após 63 dias, mas apresentaram viremia e eliminação prolongadas, e baixos níveis de citocinas pró-inflamatórias e anticorpos neutralizantes a partir do dia 28 em diante.
Curiosamente, a infecção IN reproduziu fielmente os sintomas clínicos de um surto causado pela cepa Rosalia altamente virulenta em fazendas espanholas, enquanto a infecção IM destacou o risco de transmissão nosocomial.
Antecedentes: O vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRSV) é um importante patógeno que ameaça a indústria suína global. Sua alta variabilidade e diversidade tornam as vacinas existentes inconsistentemente eficazes. Em 2020, uma cepa PRRSV-1 altamente virulenta chamada "Rosalia" surgiu na Espanha e se espalhou rapidamente, causando perdas severas (por exemplo, aumento da mortalidade durante a estação de crescimento). A análise genética sugere que ela provavelmente surgiu de uma cepa italiana altamente virulenta, PR40, por meio de recombinação. Essa cepa causa altas taxas de aborto e mortalidade (>20%) no campo, mas faltam dados experimentais sistemáticos.
Objetivos e Métodos do Estudo: Este estudo teve como objetivo caracterizar de forma abrangente a cepa PRRSV-1 altamente virulenta isolada do surto de Rosalia usando experimentos in vitro e in vivo. Leitões de oito semanas de idade foram inoculados por meio de ambas as vias de infecção intramuscular (IM) e intranasal (IN) (IM é a via experimental comumente usada, enquanto IN simula a infecção natural).
Objetivos do Teste: Documentação detalhada dos sinais clínicos e mortalidade; exames patológicos grosseiros, microscópicos e imuno-histoquímicos de porcos falecidos/necropsiados; cargas virais em soro, saliva, swabs nasais, swabs retais e tecidos, bem como isolamento viral, foram realizados para entender a dinâmica viral e a transmissibilidade; e as respostas imunes foram avaliadas pela análise dos níveis de anticorpos específicos e neutralizantes para PRRSV, bem como dos níveis de citocinas séricas.
Significado Principal: Este estudo fornecerá um modelo experimental chave e uma base de dados para avaliar a eficácia das vacinas existentes, desenvolver novas vacinas e entender melhor a patogênese desta cepa altamente virulenta.
Resultados
1. Análise Filogenética das Cepas PRRSV-1 e Caracterização da Sequência de Aminoácidos Nsp2
Características Genômicas e Posicionamento Filogenético:
O sequenciamento profundo (286×) confirmou que o genoma da cepa PRRSV-1 Lleida 029_22 tem 14.858 nt de comprimento (Figura 1A), pertencendo filogeneticamente à linhagem do subtipo 1 do PRRSV-1. Essa cepa forma um clado independente de outras três cepas associadas ao surto de Rosalia (Figura 1A), compartilhando identidade de nucleotídeos de 96,61%-97,26%, e é homóloga à cepa PR40 altamente patogênica.
Caracterização da Deleção Nsp2:
A proteína Nsp2 da cepa Lleida 029_22 exibe uma deleção de 63 aminoácidos (posições 317-379 em relação à cepa Lelystad) (Figura 1B). Essa deleção é conservada dentro do clado Rosalia, enquanto a deleção em sua cepa homóloga, PR40, é ainda maior (Figura 1A), sugerindo que essa variação genética surgiu no início da evolução do clado.
Figura 1. Árvore filogenética da cepa PRRSV-1 Lleida 029_22 e alinhamento da sequência Nsp2
(A) Árvore filogenética de máxima verossimilhança construída com base na sequência completa do genoma (modelo GTR, 1000 testes de bootstrap).
▲: Cepa Lleida 029_22 usada neste estudo; ●: Cepa associada ao surto de Rosalia.
(B) Alinhamento parcial da sequência de aminoácidos Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).
Cepas comparadas: Lleida 029_22, cepa associada ao surto de Rosalia, cepa PR40 altamente virulenta e cepa protótipo Lelystad.
*Nota: Nsp2, proteína não estrutural 2; PRRSV-1, vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína tipo 1.
2. Características de replicação in vitro da cepa PRRSV-1 Lleida 029_22
Primeiramente, as características de replicação da cepa Lleida 029_22 foram avaliadas in vitro. Essa cepa se replicou eficientemente em PAMs e células PAM-KNU, mas não em células MARC-145 (Figura 2A). As curvas de crescimento viral nos três tipos de células mostraram títulos virais semelhantes em PAMs e células PAM-KNU, embora as últimas tivessem títulos ligeiramente menores (Figura 2B). Em 72 horas, ambos os tipos de células atingiram títulos virais de aproximadamente 10⁵TCID₅₀/mL. Em contraste, as células MARC-145 foram incapazes de sustentar uma infecção viral eficiente, com os títulos virais caindo para níveis indetectáveis após 72 horas.
Figura 2. Cinética de Crescimento de PRRSV-1 Lleida 029_22 em Três Linhagens Celulares
(A) Microscopia de fluorescência 72 horas após a infecção (MOI = 0,1, coloração com anticorpo anti-proteína N; objetivo 20x)
(B) Dinâmica dos títulos virais em células PAM-KNU (média ± DP de três experimentos independentes)
*Nota: MOI, multiplicidade de infecção; PAM, macrófagos alveolares primários; PRRSV-1, vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína tipo 1.
3. Manifestações Clínicas e Mortalidade em Porcos Infectados com Lleida 029_22
A patogenicidade do PRRSV-1 Lleida 029_22 foi avaliada por meio de vias de inoculação intramuscular (IM) e intranasal (IN). Os porcos no grupo IM mostraram um aumento na temperatura corporal a partir de 1 dpi, excedendo 41°C em 7 dpi e persistindo até 13 dpi. O grupo de inoculação intranasal exibiu uma febre mais branda, excedendo brevemente 41°C em 5 dias após a inoculação, seguido por um padrão de febre intermitente. O grupo controle não apresentou temperaturas corporais anormais durante todo o experimento (Figura 3A).
As observações clínicas revelaram que o grupo infectado por IM apresentou desconforto respiratório agudo, sintomas neurológicos, dispneia grave e cianose das orelhas e do escroto, enquanto o grupo infectado por IN apresentou principalmente dispneia moderada e persistente. Sinais clínicos adicionais incluíram pelagem irregular, edema (mais pronunciado nos membros e pescoço), inflamação das articulações e deterioração geral da condição corporal em ambos os grupos, mas estes foram mais graves no grupo IM. Essas manifestações clínicas graves foram concentradas principalmente entre 12 e 14 dias após a inoculação, coincidindo com o período de alta mortalidade ou eutanásia por razões de bem-estar.
No geral, os escores clínicos no grupo infectado por IM foram significativamente maiores do que os do grupo infectado por IN em 11, 12 e 14 dias após a inoculação (p < 0,05), atingindo o pico em 14 dias após a inoculação (Figura 3B). Os escores clínicos no grupo IN foram menores, atingindo seu pico em 13 dias após a infecção (dpi). Os sintomas diminuíram gradualmente a partir daí, mas os escores permaneceram significativamente maiores do que os do grupo controle (p < 0,05). Nenhum sintoma clínico foi observado no grupo controle durante todo o experimento (Figura 3B).
A análise do modelo misto linear (levando em consideração a não independência das observações do mesmo animal em diferentes pontos no tempo) revelou que as variáveis específicas do grupo e do dia influenciaram significativamente a temperatura corporal e os escores clínicos durante os primeiros 14 dias (p < 0,05). Diferenças significativas foram encontradas entre os grupos IM e IN, bem como entre ambos os grupos de infecção e o grupo controle.
A análise de sobrevida mostrou que todos os animais do grupo de infecção IM morreram antes de 14 dias após a infecção, com uma taxa de mortalidade de 100%. As mortes naturais ou induzidas foram concentradas entre 12 e 14 dias após a infecção. No grupo de infecção IN, a mortalidade foi de 30% em 63 dias após a infecção, com mortes ocorrendo em 12, 21 e 43 dias após a infecção. Todos os animais do grupo controle sobreviveram até o final do experimento (Figura 3C).
Figura 3. Resultados Clínicos em Porcos Infectados com PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) Temperaturas Retais Diárias Pós-Infecção (Linha Tracejada Vermelha: Limiar de Febre >41°C; Média ± DP)
(B) Pontuação Clínica Média Diária (Média ± DP; Letras Idênticas Indicam Nenhuma Diferença Significativa Entre os Grupos, p < 0,05)
(C) Curvas de Sobrevivência para Grupos Experimentais
Nota: C, grupo controle; IM, grupo intramuscular; IN, grupo intranasal.
4. Viremia e Eliminação Viral em Animais Infectados por PRRSV
Os níveis de viremia após a infecção por PRRSV-1 Lleida 029_22 foram avaliados por RT-qPCR. O RNA do PRRSV foi detectado no soro de todos os animais infectados em 3 dias após a infecção, com diferenças significativas entre os grupos IM e IN em comparação com o grupo controle, que permaneceu negativo (p < 0,05; Figura 4A). A viremia no grupo IN atingiu o pico em 7 dias após a infecção, enquanto as cargas virais no grupo IM foram significativamente maiores do que as dos grupos IN e controle em 7 e 14 dias após a infecção (p < 0,05). Posteriormente, a carga viral no grupo IN diminuiu gradualmente, mas ainda era significativamente maior do que a do grupo controle em 28 dpi.
Figura 4. A eliminação viral foi avaliada por swabs de saliva e nasais/retais. Todos os animais infectados testaram positivo para o vírus em 3 dpi em swabs de saliva, nasais e retais.
A eliminação salivar continuou até 14 dpi no grupo IM e até o final do experimento no grupo IN (pico em 3 dpi; Figura 4B).
A eliminação nasal atingiu o pico em 7 dpi em ambos os grupos, com cargas virais significativamente maiores no grupo IM em 7/14 dpi do que no grupo IN (*p<0,05; Figura 4C).
A eliminação retal continuou até 14 dpi no grupo IM e até 35 dpi no grupo IN (com um ligeiro rebote em 56 dpi), com ambos os picos em 7 dpi (Figura 4D).
A análise AUC confirmou que as cargas virais em todas as amostras dos grupos infectados foram significativamente maiores do que as do grupo controle, e que as cargas dos swabs nasais no grupo IM foram maiores do que as do grupo IN (*p<0,05). Em resumo, a eliminação do PRRSV ocorre precocemente e é sustentada após a infecção.
5. Verificação do Isolamento do PRRSV Infeccioso a partir de Amostras Positivas por RT-qPCR
Para confirmar a presença de vírus infeccioso em amostras positivas por RT-qPCR, experimentos de isolamento viral (VI) foram realizados usando células PAM-KNU (Figura 5). Para amostras de soro, a taxa de sucesso do isolamento viral foi de 100% (10/10) para amostras coletadas entre 3 e 14 dias após a inoculação (dpi) no grupo IM e 100% (10/10) para amostras coletadas entre 3 e 7 dias após a inoculação (dpi) no grupo IN. No entanto, a taxa de sucesso diminuiu gradualmente em 14 dias após a inoculação (70%), 21 dias após a inoculação (55,6%) e 28 dias após a inoculação (12,5%).
Figura 5. Três cepas de vírus infecciosas foram isoladas com sucesso a partir de amostras de saliva coletadas de ambos os animais infectados em 3 dias após a infecção (dpi) após duas passagens de cultura. Nenhum vírus infeccioso foi isolado de swabs nasais ou retais.
6. Respostas de Citocinas Induzidas pela Infecção por PRRSV-1 Lleida 029_22
Amostras de soro foram coletadas durante os primeiros 14 dias após a infecção para avaliar os níveis de citocinas, revelando diferenças significativas entre os três grupos (Figura 6). Os níveis de IFN-α foram significativamente elevados em ambos os grupos de infecção em 3, 7 e 14 dias após a infecção (dpi), com os níveis de IFN-α no grupo IM significativamente maiores do que no grupo IN em 14 dias após a infecção (p<0,05). As citocinas pró-inflamatórias IL-1α, IL-12 e IL-6 mostraram tendências semelhantes: IL-1α aumentou no grupo IN em 3 dias após a infecção e permaneceu estável, enquanto os níveis de IL-6 no grupo IM foram significativamente maiores do que no grupo controle em 7 e 14 dias após a infecção (Figura 6B, D-E). De particular importância, os níveis de IL-6 foram significativamente maiores no grupo IM do que no grupo IN em 14 dias após a infecção (p<0,05). IL-1β em ambos os grupos de animais infectados mostrou uma tendência crescente, com o grupo IM mostrando níveis significativamente maiores do que o grupo controle em 3, 7 e 14 dpi, enquanto o grupo IN mostrou uma diferença significativa apenas em 14 dpi (Figura 6C).
Figura 6. Os níveis de IL-12 foram significativamente maiores no grupo IM do que no grupo IN e no grupo controle em 14 dpi (Figura 6F). A tendência geral mostrou uma resposta de citocinas pró-inflamatórias mais forte no grupo IM, particularmente nos níveis de IL-6 em 7 e 14 dpi, que foi positivamente correlacionada com a taxa de mortalidade de 100% no grupo IM.
7. Respostas de Anticorpos Específicos e Neutralizantes em Animais Infectados com PRRSV-1 Lleida 029_22
Anticorpos específicos para PRRSV-1 e PRRSV-2 foram avaliados usando kits ELISA comerciais (Figura 7A). A soroconversão ocorreu em 70% dos animais no grupo IM e em 90% dos animais no grupo IN em 14 dpi. A razão S/P em ambos os grupos foi significativamente maior do que a do grupo controle (p < 0,05). Os níveis de anticorpos no grupo IN começaram a diminuir em 21 dpi, permaneceram estáveis em 42 dpi, se recuperaram em 56 dpi e, em seguida, diminuíram ligeiramente em 63 dpi. O grupo controle permaneceu soronegativo durante todo o experimento (S/P < 0,4).
Figura 7. Os testes de anticorpos neutralizantes mostraram que no grupo IN, apenas um baixo título de 2 log₂ foi detectado em 28 dpi, que então aumentou gradualmente para 3,71 log₂ em 56 dpi (Figura 7B). Os títulos de anticorpos variaram entre os indivíduos no mesmo ponto no tempo, e o aparecimento de anticorpos neutralizantes coincidiu com a eliminação do vírus infeccioso do soro após 28 dpi (Figura 4B). Nenhum anticorpo neutralizante foi detectado no grupo controle.
8. Detecção e Isolamento de PRRSV-1 Lleida 029_22 em Homogeneizados de Tecidos
RT-qPCR foi usado para medir as cargas virais em vários tecidos (Figura 4F). No grupo IM, as cargas virais foram relativamente consistentes em todos os tecidos, com as cargas mais altas nos pulmões, linfonodos mediastinais e baço. No grupo IN, as cargas virais variaram significativamente entre os tecidos, com as cargas mais altas nas amígdalas e linfonodos mediastinais. Como esperado, a carga viral geral no grupo IN foi menor do que no grupo IM, o que pode estar relacionado ao tempo diferente da necropsia. A variabilidade significativa nas cargas teciduais em animais infectados no grupo IN também foi associada a diferentes momentos da morte (amostras cinzentas em 12, 21 e 43 dpi versus 63 dpi). Nenhum RNA viral foi detectado em nenhuma amostra de tecido do grupo controle.
Tabela 1. Tecidos coletados de animais que morreram em 12, 21 ou 43 dias após a infecção testaram positivo para aVI.
(Nota da Tabela: A Tabela 1 resume os resultados de RT-qPCR e isolamento viral de amostras de tecido. "MLN" denota linfonodos mediastinais e "ILN" denota linfonodos inguinais.)
9. Análise Patológica e Imuno-histoquímica de Tecidos Infectados por PRRSV
Achados da necropsia: Animais que morreram após a infecção por PRRSV (particularmente aqueles que morreram entre 12 e 21 dias após a infecção) mostraram lesões sistêmicas significativas, incluindo pele purpúrica, edema generalizado, linfadenopatia grave, esplenomegalia (às vezes com hiperplasia folicular) e hemorragia gástrica. As lesões pulmonares foram proeminentes, demonstrando colapso parcial, consolidação multifocal e máculas marrom-avermelhadas, consistentes com pneumonia intersticial, com lesões mais graves em animais que morreram precocemente (Figura 8A). Aproximadamente 20% dos animais com infecção intranasal também desenvolveram abscessos, pericardite e artrite causados por infecção bacteriana secundária. Nenhuma lesão macroscópica foi observada em animais controle.
Figura 8. A análise histopatológica mostrou que os escores de pneumonia intersticial em animais que morreram precocemente (12-21 dpi) nos grupos IM e IN variaram de 1,83 a 3,33 pontos. No entanto, esses escores foram significativamente reduzidos em animais sacrificados em 63 dpi (grupo controle, 0,17-0,83 pontos; grupo IN, 0,50-1,17 pontos). De particular importância, o escore histológico da amígdala no grupo IN foi significativamente maior do que no grupo controle em 63 dpi (p<0,05), mas nenhuma diferença significativa foi observada em outros tecidos (Figura 8C).
(Legenda: A Figura 8B mostra os escores histopatológicos, e a Figura 8C compara os escores histológicos dos vários grupos em 63 dpi)
A patologia microscópica revelou pneumonia intersticial (espessamento da parede alveolar, proliferação celular e infiltração de células inflamatórias) nos pulmões de todos os animais infectados. Exsudatos e tecido necrótico estavam presentes dentro dos alvéolos, juntamente com sinais de danos vasculares. O tecido linfóide (linfonodos e baço) mostrou linfopenia e necrose graves, acompanhadas de danos vasculares (por exemplo, trombose e vasculite). Infiltração de células inflamatórias perivasculares, edema e gliose foram observados na substância branca do cérebro (Figura 9A).
A análise imuno-histoquímica (IHC) detectou antígenos PRRSV em macrófagos e, ocasionalmente, em pneumócitos tipo II, dos pulmões, linfonodos, amígdalas e baços de animais infectados (Figura 9B). Antígenos virais também foram detectados em células inflamatórias perivasculares no cérebro.
Figura 9. A infecção por PRRSV causa danos patológicos extensos nos pulmões, tecidos linfóides e cérebro, principalmente localizados dentro dos macrófagos, exibindo características patológicas sistêmicas.
Discussão
O PRRSV tem um tropismo restrito para linhagens de células monócitos e tem sido tradicionalmente isolado e cultivado usando macrófagos alveolares (PAMs) e células MARC-145. No entanto, os PAMs são difíceis de obter e têm grande variabilidade lote a lote, e cepas altamente patogênicas são difíceis de adaptar ao MARC-145. Neste estudo, usamos a linhagem celular imortalizada PAM-KNU, que é sensível a certas cepas de campo, em vez de PAMs. Isolamos com sucesso a cepa Lleida 029_22, cuja curva de crescimento foi semelhante à observada em PAMs. Atualmente, não existe uma linhagem celular universal adequada para todas as cepas de PRRSV, e esforços futuros são necessários para identificar linhagens celulares mais adequadas para o isolamento de diversas cepas.
Conclusão
Este estudo estabeleceu com sucesso um modelo de infecção intranasal com uma cepa PRRSV-1 altamente virulenta. As manifestações clínicas (alta mortalidade, sintomas graves, febre alta persistente e viremia) se assemelham muito às observadas em surtos de campo. A principal descoberta foi que a via de infecção afetou significativamente o resultado: a infecção intramuscular (IM) resultou em 100% de mortalidade aguda, enquanto a infecção intranasal (IN) teve uma taxa de mortalidade de apenas 30%, e os porcos infectados eventualmente se recuperaram completamente. Essa diferença significativa destaca o risco de que as práticas de injeção IM na fazenda possam exacerbar significativamente a gravidade da epidemia por meio da transmissão nosocomial.
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