Unternehmensnachrichten über Das Virus des Reproduktions- und Atemwegssyndroms bei Schweinen Typ 1 ist bei Schweinen sehr virulent

Das Reproduktions- und Atemwegssyndrom von Schweinen (PRRS) gehört nach wie vor zu den wichtigsten Infektionskrankheiten der weltweiten Schweineindustrie.Die jüngste Entstehung eines hochpathogenen PRRSV-1-Stamms im Nordosten Spaniens (zuerst im Jahr 2020 festgestellt) hat neue Herausforderungen für die Krankheitsbekämpfung dargestellt.Obwohl diese virulenten Stämme in der Praxis verheerend sind, muss ihre umfassende experimentelle Charakterisierung noch vollständig untersucht werden.Diese Studie untersuchte systematisch die genetischen Ursprünge, in vitro-Replikationsmerkmale und Pathogenitätsmechanismen des neu entstandenen, hochpathogenen spanischen PRRSV-1-Stamms Lleida 029_22,Durch zwei Infektionswege (intramuskulär und intranasal).

In einer kürzlich in der Wiley Online Library veröffentlichten Studie wurden die genetischen Merkmale und die Pathogenität des hochpathogenen PRRSV-1-Stamms Lleida 029_22 bei Schweinen analysiert.Die phylogenetische Analyse ergab, dass der Lleida 029_22-Stamm zu einem neuen Klade gehört, der mit dem PRRSV-1 Rosalia-Ausbruch in Verbindung gebracht wird und homolog mit dem hochpathogenen italienischen Stamm PR40 ist.Dieser Stamm repliziert sich effizient in Schweinealveolarmakrophagen und PAM-KNU-Zellen in vitro, aber nicht in MARC-145-Zellen.

Zur Bewertung der Pathogenität wurden achtwöchige Ferkel mit der gleichen Dosis von 2×105 TCID5 von Lleida 029_22 durch intramuskuläre (IM) und intranasale (IN) Injektionen geimpft.Die Immunisierung durch den Mund führte zu einer Mortalität von 100% innerhalb von 14 Tagen., begleitet von hoher Virämie, hoher Virenabgabe, signifikant erhöhten Proinflammatorzytokin-Spiegeln (insbesondere IL-6) und schweren Lungenläsionen.Bei Schweinen, die mit dem IN-Impfstoff geimpft wurden, war die Sterblichkeitsrate (30%) niedriger und die klinischen Symptome mäßig.Die Überlebenden erholten sich nach 63 Tagen, zeigten jedoch seit dem 28. Tag eine längere Virämie und Abfluss sowie niedrige proinflammatorische Zytokine und neutralisierende Antikörper.

Interessanterweise hat IN Infektion die klinischen Symptome eines Ausbruchs, verursacht durch den hoch virulenten Rosalia-Stamm auf spanischen Farmen, treu wiederholt.Während die Infektion durch die innere Infektion das Risiko einer nosocomialen Übertragung hervorhob.

Hintergrund: Das Schweine-Reproduktions- und Atemwegssyndromvirus (PRRSV) ist ein wichtiger Krankheitserreger, der die weltweite Schweineindustrie bedroht.Seine hohe Variabilität und Vielfalt machen bestehende Impfstoffe inkonsistent wirksamIm Jahr 2020 tauchte in Spanien ein hoch virulenter PRRSV-1-Stamm namens "Rosalia" auf und verbreitete sich rasch, was zu schweren Verlusten führte (z. B. erhöhte Sterblichkeit während der Wachstumssaison).Genetische Analysen deuten darauf hin, dass es wahrscheinlich von einem hoch virulenten italienischen Stamm stammt.Dieser Stamm verursacht in der Praxis hohe Abtreibungs- und Sterblichkeitsraten (> 20%), aber systematische experimentelle Daten fehlen.

Studienziele und -methoden: Ziel dieser Studie war es, den aus dem Rosalia-Ausbruch isolierten hoch virulenten PRRSV-1-Stamm unter Verwendung von In-vitro- und In-vivo-Experimenten umfassend zu charakterisieren.Achtwöchige Ferkel wurden sowohl intramuskulär (IM) als auch intranasal (IN) durch die Infektionswege (IM ist der häufig verwendete Versuchsweg) geimpft., während IN eine natürliche Infektion simuliert).

Testziele: detaillierte Dokumentation der klinischen Anzeichen und der Mortalität; gross-, mikroskopische und immunhistochemische pathologische Untersuchungen von toten/obduktierten Schweinen; Viruslast im Serum,Speichel, Nasenstaubproben, Rektalstaubproben und Gewebe sowie Virusisolation wurden durchgeführt, um die Virendynamik und die Übertragbarkeit zu verstehen;Immunreaktionen wurden durch Analyse der PRRSV-spezifischen und neutralisierenden Antikörperwerte bewertet., sowie Serumsytokinwerte.

Wichtige Bedeutung: Diese Studie wird ein wichtiges experimentelles Modell und eine Datenbasis für die Bewertung der Wirksamkeit bestehender Impfstoffe, die Entwicklung neuer Impfstoffe,und die Pathogenese dieses hoch virulenten Stammes besser zu verstehen.

Ergebnisse

1. Phylogenetische Analyse von PRRSV-1-Stämmen und Charakterisierung der Aminosäuresequenz von Nsp2

Genomische Merkmale und phylogenetische Positionierung:

Eine tiefe Sequenzierung (286x) bestätigte, dass das Genom des PRRSV-1 Lleida 029_22-Stamms 14,858 nt lang ist (Abbildung 1A), phylogenetisch zur PRRSV-1-Subtyp-1-Linie gehört.Dieser Stamm bildet einen unabhängigen Claden von drei anderen mit dem Ausbruch von Rosalia assoziierten Stämmen (Abbildung 1A), die eine Nukleotid-Identität von 96,61% bis 97,26% teilt und homolog mit dem hochpathogenen PR40-Stamm ist.

Nsp2-Löschchcharakterisierung:

Das Nsp2-Protein des Stammes Lleida 029_22 weist eine 63-amino-Säure-Deletion (Positionen 317-379 im Vergleich zum Lelystad-Stamm) auf (Abbildung 1B).während die Deletion in seinem homologen Stamm, PR40, ist noch größer (Abbildung 1A), was darauf hindeutet, dass diese genetische Variation früh in der Evolution des Klades entstanden ist.

Abbildung 1. Phylogenetischer Baum von PRRSV-1 Lleida 029_22 Stamm und Sequenz-Ausrichtung von Nsp2
(A) Maximaler Wahrscheinlichkeit phylogenetischer Baum auf der Grundlage der gesamten Genomsequenz konstruiert (GTR-Modell, 1000 Bootstrap-Tests).

▲: Lleida 029_22 Stamm, der in dieser Studie verwendet wurde; ●: Rosalia-Ausbruch-assoziierte Stamm.
(B) Teilweise Ausrichtung der Aminosäuresequenz von Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1).

Vergleichte Stämme: Lleida 029_22, Rosalia-Ausbruch-assoziierte Stamm, hoch virulent PR40 Stamm und Prototyp Lelystad Stamm.
*Anmerkung: Nsp2, nichtstrukturelles Protein 2; PRRSV-1, Virus des Fortpflanzungs- und Atemwegssyndroms von Schweinen Typ 1.

2In vitro-Replikationsmerkmale von PRRSV-1 Lleida 029_22 Stamm

Zunächst wurden in vitro die Replikationsmerkmale des Stamms Lleida 029_22 ausgewertet, der sich in PAM- und PAM-KNU-Zellen effizient replizierte, jedoch nicht in MARC-145-Zellen (Abbildung 2A).Virenwachstumskurven in den drei Zelltypen zeigten ähnliche Virentitre in PAM- und PAM-KNU-Zellen.Nach 72 Stunden erreichten beide Zelltypen virale Titer von ca. 105TCID50/ml.MARC-145-Zellen konnten keine wirksame Virusinfektion aufrechterhalten, wobei die Virentiter nach 72 Stunden auf nicht nachweisbare Werte sinken.

Abbildung 2. Wachstumskinetik von PRRSV-1 Lleida 029_22 in drei Zelllinien
(A) Fluoreszenzmikroskopie 72 Stunden nach der Infektion (MOI = 0).1, Färbung mit Anti-N-Protein-Antikörpern; 20x Ziel)
(B) Dynamik der Virustitre in PAM-KNU-Zellen (Durchschnitt ± SD von drei unabhängigen Versuchen)
*Anmerkung: MOI, Multiplizität der Infektion; PAM, primäre alveolare Makrophagen; PRRSV-1, Virus des reproduktiven und respiratorischen Syndroms von Schweinen Typ 1.

3. Klinische Erscheinungsformen und Mortalität bei mit Lleida infizierten Schweinen 029_22

Die Pathogenität von PRRSV-1 Lleida 029_22 wurde durch intramuskuläre (IM) und intranasale (IN) Injektionswege beurteilt.mit einem Durchmesser von mehr als 40 mmDie intranasal injizierte Gruppe zeigte ein leichteres Fieber, das nur kurz nach 5 Tagen nach der Impfung 41°C überstieg, gefolgt von einem intermittierenden Fiebermuster.Die Kontrollgruppe zeigte während des gesamten Versuchs keine abnormalen Körpertemperaturen (Abbildung 3A)..

Klinische Beobachtungen zeigten, dass die mit IM infizierte Gruppe akute Atemnot, neurologische Symptome, schwere Atemnot und Zyanose der Ohren und des Hodensackes erlebte.Die IN-infizierte Gruppe zeigte hauptsächlich moderateZusätzliche klinische Anzeichen waren in beiden Gruppen zerlumptes Fell, Ödem (am stärksten an den Gliedmaßen und Hals), Gelenkentzündung und eine allgemeine Verschlechterung des Körperzustands.Diese waren jedoch in der IM-Gruppe schwerwiegender.Diese schweren klinischen Manifestationen konzentrierten sich in erster Linie zwischen 12 und 14 Tagen nach der Impfung, was mit der Periode hoher Sterblichkeit oder Euthanasie aus Wohlfahrtsgründen zusammenfällt.

Insgesamt waren die klinischen Ergebnisse in der IM-infizierten Gruppe 11, 12 und 14 Tage nach der Impfung signifikant höher als in der IN-infizierten Gruppe (p < 0,05),Spitzenwert 14 Tage nach der Impfung (Abbildung 3B)Die klinischen Ergebnisse in der IN-Gruppe waren niedriger und erreichten ihren Höchststand 13 Tage nach der Infektion (dpi).Die Ergebnisse waren jedoch deutlich höher als in der Kontrollgruppe (p < 0)..05) Während des gesamten Versuchs wurden in der Kontrollgruppe keine klinischen Symptome beobachtet (Abbildung 3B).

Linear mixed model analysis (accounting for the non-independence of observations from the same animal at different time points) revealed that group- and day-specific variables significantly influenced body temperature and clinical scores during the first 14 days (p < 0.05) Es wurden signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen IM und IN sowie zwischen den beiden Infektionsgruppen und der Kontrollgruppe festgestellt.

Die Überlebensanalyse ergab, dass alle Tiere in der IM-Infektionsgruppe vor 14 Tagen nach der Infektion mit einer Sterblichkeitsrate von 100% starben.Natürliche oder verursachte Todesfälle konzentrierten sich zwischen 12 und 14 Tagen nach der Infektion.In der IN-Infektionsgruppe betrug die Mortalität 30% bis 63 Tage nach der Infektion, wobei die Todesfälle 12, 21 und 43 Tage nach der Infektion auftraten.Alle Tiere in der Kontrollgruppe überlebten bis zum Ende des Experiments (Abbildung 3C)..

Abbildung 3. Klinische Ergebnisse bei mit PRRSV-1 infizierten Schweinen Lleida 029_22
(A) Tägliche Rektaltemperaturen nach der Infektion (rote gestrichelte Linie: Fieberschwelle > 41°C; Mittel ± SD)
(B) Durchschnittlicher klinischer Tagesscore (Mittelwert ± SD; identische Buchstaben zeigen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen an, p < 0,05)
(C) Überlebenskurven für Versuchsgruppen
Anmerkung: C, Kontrollgruppe; IM, intramuskuläre Gruppe; IN, intranasal.

4Virämie und Virenabbau bei mit PRRSV infizierten Tieren

Die Virämiewerte nach einer Infektion mit PRRSV-1 Lleida 029_22 wurden mit RT-qPCR bewertet.mit signifikanten Unterschieden zwischen den Gruppen IM und IN im Vergleich zur Kontrollgruppe, die negativ blieb (p < 0.05Die Virämie in der IN-Gruppe erreichte ihren Höhepunkt 7 Tage nach der Infektion.Während die Viruslast in der IM-Gruppe signifikant höher war als in der IN- und der Kontrollgruppe sowohl 7 als auch 14 Tage nach der Infektion (p < 0)..05). Danach ging die Viruslast in der IN-Gruppe allmählich zurück, lag aber immer noch deutlich höher als in der Kontrollgruppe bei 28 dpi.

Abbildung 4 Die Virenabgabe wurde anhand von Speichel- und Nasen-/Rektalschablonen beurteilt. Alle infizierten Tiere wurden bei 3 dpi in Speichel-, Nasen- und Rektalschablonen positiv auf Virus getestet.

Die Speichelentwöhnung dauerte bis zu 14 dpi in der IM-Gruppe und bis zum Ende des Experiments in der IN-Gruppe (Peak bei 3 dpi; Abbildung 4B) an.

Das Nasenvergießen erreichte in beiden Gruppen einen Höhepunkt von 7 dpi, wobei die Viruslast in der IM-Gruppe bei 7/14 dpi signifikant höher war als in der IN-Gruppe (*p<0.05(Abbildung 4C).

Die Rektalvergießung setzte sich in der IM-Gruppe bis zu 14 dpi und in der IN-Gruppe bis zu 35 dpi fort (mit einem leichten Rückschlag bei 56 dpi), wobei beide Spitzen bei 7 dpi lagen (Abbildung 4D).

Die AUC-Analyse bestätigte, dass die Viruslast in allen Proben der infizierten Gruppen signifikant höher war als in der Kontrollgruppe.und dass die Nasenstaubbelastung in der IM-Gruppe höher war als in der IN-Gruppe (*p<0.05). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Abgabe von PRRSV frühzeitig erfolgt und nach der Infektion anhält.

5Überprüfung der Isolierung von infektiösem PRRSV aus RT-qPCR-positiven Proben

Um das Vorhandensein von Infektionsvirus in RT-qPCR-positiven Proben zu bestätigen, wurden Virusisolationsversuche (VI) mit PAM-KNU-Zellen durchgeführt (Abbildung 5). the success rate of virus isolation was 100% (10/10) for samples collected between 3 and 14 days post-inoculation (dpi) in the IM group and 100% (10/10) for samples collected between 3 and 7 days post-inoculation (dpi) in the IN groupDie Erfolgsrate sank jedoch allmählich bei 14 Tagen nach der Impfung (70%), 21 Tagen nach der Impfung (55,6%) und 28 Tagen nach der Impfung (12,5%).

Abbildung 5. Drei ansteckende Virusstämme wurden erfolgreich aus Speichelproben isoliert, die 3 Tage nach der Infektion (dpi) nach zwei Kulturpassagen von beiden infizierten Tieren entnommen wurden.Aus Nasen- oder Rektalschablonen wurde kein Infektionsvirus isoliert..

6. Zytokinergebnisse durch PRRSV-1 Lleida 029_22 Infektion induziert

Während der ersten 14 Tage nach der Infektion wurden Serumproben entnommen, um die Zytokinspiegel zu beurteilen, was signifikante Unterschiede zwischen den drei Gruppen aufdeckte (Abbildung 6).Die IFN-α-Spiegel waren in beiden Infektionsgruppen signifikant erhöht.Proinflammatorische Zytokine IL-1α, IL-12,und IL-6 ähnliche Trends zeigten.: IL-1α stieg in der IN-Gruppe 3 Tage nach der Infektion an und blieb stabil,Während die IL-6-Spiegel in der IM-Gruppe 7 und 14 Tage nach der Infektion signifikant höher waren als in der Kontrollgruppe (Abbildung 6B).Besonders bemerkenswert waren die IL-6-Spiegel in der IM-Gruppe signifikant höher als in der IN-Gruppe 14 Tage nach der Infektion (p<0,05).IL-1β zeigte in beiden Gruppen infizierter Tiere einen steigenden Trend., wobei die IM-Gruppe deutlich höhere Werte als die Kontrollgruppe bei 3, 7 und 14 dpi aufwies, während die IN-Gruppe nur bei 14 dpi einen signifikanten Unterschied aufwies (Abbildung 6C).

Abbildung 6. Die IL-12-Spiegel waren in der IM-Gruppe signifikant höher als in der IN-Gruppe und der Kontrollgruppe bei 14 dpi (Abbildung 6F).Der allgemeine Trend zeigte eine stärkere proinflammatorische Zytokinenreaktion in der IM-Gruppe.Das war positiv mit der 100-prozentigen Mortalität in der IM-Gruppe korreliert.

7. Spezifische und neutralisierende Antikörperreaktionen bei mit PRRSV-1 infizierten Tieren Lleida 029_22

PRRSV-1- und PRRSV-2-spezifische Antikörper wurden mit kommerziellen ELISA-Kits bewertet (Abbildung 7A).Bei 70% der Tiere in der IM-Gruppe und bei 90% der Tiere in der IN-Gruppe kam es bei 14 dpi zu einer Serokonversion.Die Antikörperwerte in der IN-Gruppe begannen bei 21 dpi zu sinken, blieben bei 42 dpi stabil.bei 56 dpi zurückgeschlagenDie Kontrollgruppe blieb während des gesamten Experiments seronegativ (S/P < 0,4).

Abbildung 7. Neutralisierende Antikörpertests zeigten, dass in der IN-Gruppe nur ein niedriger Titer von 2 log2 bei 28 dpi festgestellt wurde, der dann allmählich auf 3,71 log2 bei 56 dpi anstieg (Abbildung 7B).Die Antikörpertiter variierten zwischen den Individuen zum selben Zeitpunkt.In der Kontrollgruppe wurden keine neutralisierenden Antikörper nachgewiesen..

8. Nachweis und Isolierung von PRRSV-1 Lleida 029_22 in Gewebehomogenaten

RT-qPCR wurde verwendet, um die Viruslast in verschiedenen Geweben zu messen (Abbildung 4F).Lymphknoten im MediastinIn der IN-Gruppe variierten die Virusbelastungen signifikant zwischen den Geweben, wobei die größten Belastungen in den Mandeln und den mediastinalen Lymphknoten auftraten.Die Gesamtvirenlast in der IN-Gruppe war niedriger als in der IM-Gruppe., was möglicherweise mit der unterschiedlichen Zeit der Autopsie zusammenhängt.Die signifikante Variabilität der Gewebebelastung bei infizierten Tieren in der IN-Gruppe war auch mit unterschiedlichen Todeszeiten verbunden (Ausgegraute Proben bei 12In keiner Gewebeprobe der Kontrollgruppe wurde virale RNA nachgewiesen.

Tabelle 1. Gewebe, die von Tieren entnommen wurden, die 12, 21 oder 43 Tage nach der Infektion positiv auf aVI getestet wurden.

(Tabellenangabe: Tabelle 1 fasst die Ergebnisse der RT-qPCR und der Virusisolation aus Gewebeproben zusammen. "MLN" bezeichnet mediastinale Lymphknoten und "ILN" die Inguinal-Lymphknoten.)

9. Pathologische und immunhistochemische Analyse von mit PRRSV infizierten Geweben

Obduktionsergebnisse: Tiere, die nach einer PRRSV-Infektion gestorben sind (insbesondere Tiere, die zwischen 12 und 21 Tagen nach der Infektion gestorben sind), zeigten signifikante systemische Läsionen, einschließlich violeter Haut,Verallgemeinerter ÖdemLungenläsionen waren ausgeprägt und zeigten einen teilweisen Zusammenbruch, eine multifokale Konsolidierung,und rotbraune Flecken, die mit interstitialer Lungenentzündung übereinstimmt, mit schwereren Läsionen bei Tieren, die frühzeitig starben (Abbildung 8A).PerikarditisBei Kontrolltieren wurden keine schwerwiegenden Läsionen beobachtet.

Schaubild 8. Die histopathologische Analyse ergab, dass die Interstitialpneumonie-Werte bei Tieren, die in den IM- und IN-Gruppen früh (12-21 dpi) starben, zwischen 1,83 und 3,33 Punkten lagen.Diese Punkte wurden bei Tieren, die bei 63 dpi geschlachtet wurden (Kontrollgruppe), signifikant reduziert.Besonders bemerkenswert war, dass der histologische Tonsilwert in der IN-Gruppe signifikant höher war als in der Kontrollgruppe bei 63 dpi (p<0,05).in anderen Geweben jedoch keine signifikanten Unterschiede beobachtet wurden (Abbildung 8C).

(Beschriftung: Abbildung 8B zeigt die histopathologischen Werte und Abbildung 8C vergleicht die histologischen Werte der verschiedenen Gruppen bei 63 dpi)

Mikroskopische Pathologie ergab interstitielle Lungenentzündung (Verdickung der Alveolarwand, Zellproliferation und Entzündungszellinfiltration) in den Lungen aller infizierten Tiere.Exsudate und nekrotisches Gewebe waren in den Alveolen vorhandenLymphgewebe (Lymphknoten und Milz) zeigte schwere Lymphpenie und Nekrose, begleitet von Gefäßschäden (z. B. Thrombose und Vaskulitis).Inflammationszell-Infiltration im Perivaskularbereich, Ödem und Gliose wurden in der weißen Substanz des Gehirns beobachtet (Abbildung 9A).

Immunhistochemische Analysen (IHC) ergaben PRRSV-Antigene in Makrophagen und gelegentlich in Pneumozyten Typ II aus Lungen, Lymphknoten, Mandeln und Milz infizierter Tiere (Abbildung 9B).Viralantigene wurden auch in perivaskulären Entzündungszellen im Gehirn nachgewiesen.

Abbildung 9. Eine PRRSV-Infektion verursacht umfangreiche pathologische Schäden in Lungen, Lymphgewebe und Gehirn, vor allem in Makrophagen lokalisiert, die systemische pathologische Merkmale aufweisen.

Diskussion

PRRSV weist einen eingeschränkten Tropismus für monozytische Zelllinien auf und wurde traditionell mit Alveolarmakrophagen (PAMs) und MARC-145-Zellen isoliert und kultiviert.PAM sind schwer zu erhalten und haben eine große Variation von Charge zu Charge.In dieser Studie verwendeten wir die unsterbliche Zelllinie PAM-KNU, die für bestimmte Feldstämme empfindlich ist, anstelle von PAMs.Wir haben den Lleida 029_22 Stamm erfolgreich isoliert.Derzeit gibt es keine universelle Zelllinie, die für alle PRRSV-Stämme geeignet ist.und zukünftige Bemühungen erforderlich sind, geeignete Zelllinien für die Isolierung verschiedener Stämme zu identifizieren.

Schlussfolgerung

Die klinischen Manifestationen (hohe Mortalität, schwere Symptome, anhaltend hohes Fieber,und Virämie) ähneln denen, die bei Feldausbrüchen beobachtet wurden.Die wichtigste Erkenntnis war, dass der Infektionsweg das Ergebnis signifikant beeinflusste: Eine intramuskuläre Infektion führte zu einer akuten Mortalität von 100%.Während die Intra-Nasen-Infektion (IN) eine Sterblichkeitsrate von nur 30% aufwies, und die infizierten Schweine erholten sich schließlich vollständig.Dieser signifikante Unterschied unterstreicht die Gefahr, dass die Anwendung von IM-Injektionen in landwirtschaftlichen Betrieben die Schwere der Epidemie durch nosocomiale Übertragung erheblich verschlimmern könnte..