اخبار شرکت ویروس سندرم تولید مثل و تنفسی خوکی نوع ۱ در خوک ها بسیار بیماری زا است.

سندرم تناسلی و تناسلی خوک (PRRS) همچنان یکی از مهم ترین بیماری های عفونی است که بر صنعت خوک جهانی تأثیر می گذارد.ظهور اخیر یک سویه بسیار بیماری زا از PRRSV-1 در شمال شرقی اسپانیا (که برای اولین بار در سال 2020 شناسایی شد) چالش های جدیدی را برای کنترل بیماری ایجاد کرده است.اگرچه این سویه های مضر در میدان ویرانگر هستند، اما توصیف تجربی جامع آنها هنوز به طور کامل مورد بررسی قرار نگرفته است.این مطالعه به طور سیستماتیک ریشه های ژنتیکی، ویژگی های تکثیر و مکانیسم های بیماری زایی در آزمایشگاه گونه جدید اسپانیایی بسیار بیماری زای PRRSV-1، Lleida 029_22،از طریق دو مسیر عفونت (به داخل عضلات و داخل بینی).

یک مطالعه اخیر که در کتابخانه آنلاین ویلی منتشر شده است، ویژگی های ژنتیکی و بیماری زایی سویه بسیار بیماری زا PRRSV-1 Lleida 029_22 را در خوک ها تجزیه و تحلیل کرد.تجزیه و تحلیل فیلوژنیتیک نشان داد که سویه Lleida 029_22 متعلق به یک کلاد جدید است که با شیوع PRRSV-1 Rosalia مرتبط است و با سویه ایتالیا بسیار بیماری زا PR40 همسان است.این سویه به طور کارآمد در ماکروفاجهای آلبویولار خوک و سلول های PAM-KNU در آزمایشگاه تکثیر می شود، اما در سلول های MARC-145 نیست.

برای ارزیابی بیماری زا بودن آن، خوک های هشت هفته ای با همان دوز 2×105 TCID5 از Lleida 029_22 از طریق تزریق داخل عضلانی (IM) و داخل بینی (IN) تزریق شدند.واکسیناسیون در داخل روده منجر به مرگ و میر 100 درصدی در عرض 14 روز شد.در مقابل، این بیماری با ویروس بالا همراه می شود و سطح قابل توجهی از سیتوکین های سوزنده (به ویژه IL-6) و ضایعات شدید ریه را افزایش می دهد.خوک های واکسینه شده با واکسن IN دارای نرخ مرگ و میر کمتر (30٪) و علائم بالینی متوسط بودند.بازماندگان پس از ۶۳ روز بهبود یافتند، اما از روز ۲۸ و بعد از آن، ویرومیای طولانی مدت و ریزش و سطح پایین سیتوکین های پروالتهابی و آنتی بادی های خنثی کننده را نشان دادند.

جالب اينه که، اينفکشن به طور درستي علائم باليني يه شیوع ناشی از گونه ي بسيار ويروسال رو در مزرعه هاي اسپانيايي خلاصه کردهدر حالی که عفونت IM خطر انتقال بیمارستانی را برجسته می کند.

زمینه: ویروس سندرم تناسلی و تناسلی خوک (PRRSV) یک عامل بیماری بزرگ است که صنعت خوک جهانی را تهدید می کند.تنوع زیاد و تنوع آن باعث می شود که واکسن های موجود به طور متناقض موثر باشند.در سال ۲۰۲۰، یک سویه بسیار ویروس دار از ویروس PRRSV-1 به نام "روسالیا" در اسپانیا ظاهر شد و به سرعت گسترش یافت و باعث تلفات شدید (به عنوان مثال افزایش مرگ و میر در فصل رشد) شد.تجزیه و تحلیل ژنتیکی نشان می دهد که احتمالاً از یک سویه ایتالیایی بسیار خطرناک ناشی شده استاین سویه باعث می شود نرخ سقط جنین و مرگ و میر بالا (> 20٪) در این زمینه، اما داده های تجربی سیستماتیک وجود ندارد.

اهداف و روش های مطالعه: هدف این مطالعه توصیف جامع سویه بسیار ویروس دار PRRSV-1 جدا شده از شیوع Rosalia با استفاده از آزمایشات in vitro و in vivo بود.خوک های هشت هفته ای از طریق هر دو مسیر عفونت درون عضلانی (IM) و داخل بینی (IN) تزریق شدند (IM راه آزمایشی رایج است)، در حالی که IN عفونت طبیعی را شبیه سازی می کند).

اهداف آزمایش: مستندات دقیق علائم بالینی و مرگ و میر؛ معاینات پاتولوژیک ناخالص، میکروسکوپی و ایمونو هیستوشیمیک خوک های مرده/مرده؛ بار ویروسی در سرم،بزاق، پاک کننده های بینی، پاک کننده های مقعد و بافت ها، و همچنین جداسازی ویروس، برای درک پویایی و انتقال ویروس انجام شد؛پاسخ های ایمنی توسط تجزیه و تحلیل سطح آنتی بادی خاص و خنثی کننده PRRSV ارزیابی شد.، و همچنین سطح سیتوکین های سرم.

اهمیت کلیدی: این مطالعه یک مدل آزمایشی کلیدی و یک پایه داده برای ارزیابی اثربخشی واکسن های موجود، توسعه واکسن های جدید،و درک بیشتر از بیماری زایی این سویه بسیار خطرناک.

نتایج

1تجزیه و تحلیل فیلوژنیتیک سویه های PRRSV-1 و توصیف توالی اسید آمینه Nsp2

ویژگی های ژنومیک و موقعیت فیلوژنتیکی:

توالی عمیق (286 ×) تایید کرد که ژنوم سویه PRRSV-1 Lleida 029_22 14858 nt طول دارد (شکل 1A) ، از نظر فایلوجنیتیکی متعلق به زیرنوع 1 PRRSV - 1 است.این سویه یک کلاد مستقل از سه سویه دیگر مرتبط با شیوع Rosalia را تشکیل می دهد (شکل 1A)، که هویت نوکلئوتید 96.61٪ - 97.26٪ را به اشتراک می گذارد و با سویه بسیار بیماری زا PR40 همسان است.

مشخصات حذف Nsp2:

پروتئین Nsp2 از سویه Lleida 029_22 حذف اسید آمینه 63 را نشان می دهد (مواقع 317-379 نسبت به سویه Lelystad) (شکل 1B). این حذف در کلاد Rosalia حفظ می شود،در حالی که حذف در سویه همگن آن، PR40، حتی بزرگتر است (شکل 1A) ، که نشان می دهد این تغییرات ژنتیکی در اوایل تکامل کلاد ایجاد شده است.

شکل ۱. درخت فایلوجنتیکی گونه PRRSV-1 Lleida 029_22 و تراز توالی Nsp2
(A) حداکثر احتمال درخت فیلوژنیتیک ساخته شده بر اساس کل توالی ژنوم (مدل GTR، 1000 آزمایش بوت استراپ).

▲: سویه Lleida 029_22 که در این مطالعه استفاده شده است؛ ●: سویه مرتبط با شیوع Rosalia.
(ب) تراز قطعی توالی اسید آمینه Nsp2 (CLUSTAL Genomics Workbench 24.0.1)

سویه های مقایسه شده: Lleida 029_22، سویه مرتبط با شیوع بیماری Rosalia، سویه بسیار ویروس دار PR40 و نمونه اولیه سویه Lelystad.
*یادداشت: Nsp2، پروتئین غیرساختاری 2؛ PRRSV-1، ویروس سندرم تناسلی و باروری خوک نوع 1

2ویژگی های تکثیر in vitro از سویه PRRSV-1 Lleida 029_22

ابتدا، ویژگی های تکثیر گونه Lleida 029_22 در آزمایشگاه ارزیابی شد. این گونه به طور موثر در سلول های PAM و PAM-KNU تکثیر شد، اما در سلول های MARC-145 (شکل 2A) نیست.منحنی رشد ویروسی در این سه نوع سلول نشان دهنده تیترهای ویروسی مشابه در سلول های PAM و PAM-KNU است.در 72 ساعت، هر دو نوع سلول به عنوان ویروسی حدود 105TCID50/ml رسیدند. در مقابل،سلول های MARC-145 قادر به حفظ عفونت ویروسی موثر نبودند، با تیترهای ویروسی که پس از 72 ساعت به سطوح غیر قابل تشخیص کاهش می یابد.

شکل ۲. حرکتی رشد PRRSV-1 Lleida 029_22 در سه خط سلولی
(A) میکروسکوپی فلورسنت 72 ساعت پس از عفونت (MOI = 0.1، رنگ آمیزی با آنتی بادی پروتئین ضد N؛ هدف 20x)
(ب) پویایی تیترهای ویروسی در سلول های PAM-KNU (متوسط ± SD از سه آزمایش مستقل)
*یادداشت: MOI، چندگانه بودن عفونت؛ PAM، ماکروفاجهای البویولار اولیه؛ PRRSV-1، ویروس سندرم تناسلی و باروری خوک نوع 1.

3علایم بالینی و مرگ و میر در خوک های آلوده به لریدا 029_22

بیماری زا بودن PRRSV-1 Lleida 029_22 با استفاده از راه های تزریق داخل عضلات (IM) و داخل بینی (IN) ارزیابی شد. خوک ها در گروه IM افزایش دمای بدن را از 1 dpi آغاز کردند.بیش از ۴۱ درجه سانتیگراد در ۷ دی پی آیگروه واکسیناسیون داخل بینی تب خفیف تری را نشان دادند، که فقط برای مدت کوتاهی بیش از 41°C در 5 روز پس از واکسیناسیون بود، و با یک الگوی تب متناوب دنبال می شد.گروه کنترل در طول آزمایش هیچ دمای بدن غیر طبیعی را نشان ندادند (شکل 3A).

مشاهدات بالینی نشان داد که گروه مبتلا به IM دچار ناراحتی تنفسی حاد، علائم عصبی، تنگی شدید و سیانوز گوش و بیضه،در حالی که گروه مبتلا به IN عمدتاً با بیماری معتدلعلائم بالینی اضافی شامل پوست پاره شده، ورم (بیشتر در اندام ها و گردن) ، التهاب مفاصل و بدتر شدن کلی وضعیت بدن در هر دو گروه بود.اما این در گروه IM شدیدتر بود.این نشانه های بالینی شدید عمدتاً بین 12 تا 14 روز پس از واکسیناسیون متمرکز شده اند، که همزمان با دوره مرگ و میر بالا یا انسان زدایی به دلایل رفاه است.

به طور کلی، نمرات بالینی در گروه آلوده به IM به طور قابل توجهی بالاتر از گروه آلوده به IN در روز های 11، 12 و 14 پس از تزریق بود (p < 0.05).اوج 14 روز پس از واکسیناسیون (شکل 3B)نمرات بالینی در گروه IN پایین تر بود و به اوج خود در 13 روز پس از عفونت (dpi) رسید. علائم پس از آن به تدریج کاهش یافت.اما نمرات به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل باقی ماند (p < 0.05) در گروه کنترل در طول آزمایش هیچ علائم بالینی مشاهده نشد (شکل 3B).

Linear mixed model analysis (accounting for the non-independence of observations from the same animal at different time points) revealed that group- and day-specific variables significantly influenced body temperature and clinical scores during the first 14 days (p < 0تفاوت های قابل توجهی بین گروه های IM و IN و همچنین بین هر دو گروه عفونت و گروه کنترل یافت شد.

تجزیه و تحلیل بقا نشان داد که تمام حیوانات در گروه عفونت IM قبل از 14 روز پس از عفونت با نرخ مرگ و میر 100٪ درگذشتند.مرگ های طبیعی و یا ناشی از آن بین 12 تا 14 روز پس از عفونت متمرکز شده است.در گروه عفونت IN، مرگ و میر در 63 روز پس از عفونت 30 درصد بود و مرگ و میر در 12، 21 و 43 روز پس از عفونت رخ داد.تمام حیوانات گروه کنترل تا پایان آزمایش زنده ماندند (شکل 3C).

نمودار ۳. نتایج بالینی در خوک های آلوده به PRRSV-1 Lleida 029_22
(A) دمای روزانه مقعد پس از عفونت (خط قرمز تیره: آستانه تب > 41°C؛ متوسط ± SD)
(ب) میانگین نمره کلینیکی روزانه (معادل ± SD؛ حروف یکسان هیچ تفاوت قابل توجهی بین گروه ها را نشان نمی دهد، p < 0.05)
(ج) منحنی های بقا برای گروه های آزمایشی
توجه: C، گروه کنترل؛ IM، گروه عضلانی؛ IN، گروه درون بینی.

4ویرومی و از بین رفتن ویروس در حیوانات آلوده به PRRSV

سطح ویرومی پس از عفونت PRRSV-1 Lleida 029_22 با RT-qPCR ارزیابی شد. RNA PRRSV در سرم تمام حیوانات آلوده در 3 روز پس از عفونت شناسایی شد.با تفاوت های قابل توجهی بین گروه های IM و IN در مقایسه با گروه کنترل، که منفی باقی ماند (p < 0.05در گروه IN، ویرومی در 7 روز پس از عفونت به اوج خود رسید.در حالی که بار ویروسی در گروه IM به طور قابل توجهی بالاتر از گروه های IN و گروه های کنترل در هر دو 7 و 14 روز پس از عفونت بود (p < 0از آن پس، بار ویروسی در گروه IN به تدریج کاهش یافت، اما هنوز به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل در 28 dpi بود.

شکل ۴. انتشار ویروس با استفاده از بزاق و نمونه های بینی / رکتال ارزیابی شد. همه حیوانات آلوده در نمونه های بزاق، بینی و رکتال در 3 دی پی آی برای ویروس مثبت آزمایش شدند.

تخلیه بزاق تا 14 dpi در گروه IM و تا پایان آزمایش در گروه IN ادامه یافت (افق در 3 dpi؛ شکل 4B).

تخلیه بینی در هر دو گروه در 7 dpi به اوج خود رسید، با بار ویروسی قابل توجهی بالاتر در گروه IM در 7/14 dpi نسبت به گروه IN (*p<0.05(شکل 4C)

تخلیه مقعد تا 14 dpi در گروه IM و تا 35 dpi در گروه IN (با بازگشت کمی در 56 dpi) ادامه یافت، با هر دو قله در 7 dpi (شکل 4D).

تجزیه و تحلیل AUC تایید کرد که بار ویروسی در تمام نمونه های گروه های آلوده به طور قابل توجهی بالاتر از گروه های کنترل بود.و این که بار مسواک های بینی در گروه IM بالاتر از گروه IN بود (*p<0.05 به طور خلاصه، تخلیه PRRSV در اوایل رخ می دهد و پس از عفونت ادامه دارد.

5- بررسي جدايي PRRSV عفوني از نمونه هاي مثبت RT-qPCR

برای تأیید وجود ویروس عفونی در نمونه های مثبت RT-qPCR، آزمایشات جداسازی ویروس (VI) با استفاده از سلول های PAM-KNU انجام شد (شکل 5). the success rate of virus isolation was 100% (10/10) for samples collected between 3 and 14 days post-inoculation (dpi) in the IM group and 100% (10/10) for samples collected between 3 and 7 days post-inoculation (dpi) in the IN groupبا این حال، نرخ موفقیت به تدریج در 14 روز پس از واکسیناسیون (70٪) ، 21 روز پس از واکسیناسیون (55.6٪) و 28 روز پس از واکسیناسیون (12.5٪) کاهش یافت.

شکل ۵. سه سویه ویروس عفونی با موفقیت از نمونه های بزاق جمع آوری شده از هر دو حیوان آلوده در 3 روز پس از عفونت (dpi) پس از دو گذرگاه فرهنگ جدا شد.هیچ ویروس عفونی از سواب های بینی یا مقعد جدا نشده است.

6پاسخ های سیتوکین ناشی از عفونت PRRSV-1 Lleida 029_22

نمونه های سرم در طول 14 روز اول پس از عفونت برای ارزیابی سطح سیتوکین ها جمع آوری شد، که تفاوت های قابل توجهی بین سه گروه را نشان داد (شکل 6).سطح IFN-α در هر دو گروه عفونت به طور قابل توجهی افزایش یافت.، 7 و 14 روز پس از عفونت (dpi) ، با سطوح IFN-α در گروه IM به طور قابل توجهی بالاتر از گروه IN در 14 روز پس از عفونت (p<0.05).و IL-6 روند مشابهی را نشان دادند.: IL- 1α در گروه IN در 3 روز پس از عفونت افزایش یافت و پایدار ماند.در حالی که سطح IL-6 در گروه IM به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل در 7 و 14 روز پس از عفونت بود (شکل 6B)به طور خاص، سطح IL-6 در گروه IM نسبت به گروه IN در 14 روز پس از عفونت (p<0.05) به طور قابل توجهی بالاتر بود.IL-1β در هر دو گروه از حیوانات مبتلا به بیماری، روند رو به افزایش را نشان داد.، با گروه IM نشان دادن سطوح به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل در 3, 7 و 14 dpi در حالی که گروه IN نشان داد تفاوت قابل توجهی فقط در 14 dpi (شکل 6C).

شکل ۶. سطح IL-12 در گروه IM به طور قابل توجهی بالاتر از گروه IN و گروه کنترل در 14 dpi بود (شکل 6F).روند کلی نشان داد که پاسخ سیتوکین های سوزنده قوی تر در گروه IM است.، به ویژه در سطح IL-6 در 7 و 14 dpi که به طور مثبت با نرخ مرگ و میر 100٪ در گروه IM مرتبط بود.

7پاسخ های خاص و خنثی کننده آنتی بادی در حیوانات آلوده به PRRSV-1 Lleida 029_22

آنتی بادی های خاص PRRSV-1 و PRRSV-2 با استفاده از کیت های تجاری ELISA ارزیابی شدند (شکل 7A).سروکونورژن در 70% حیوانات در گروه IM و در 90% حیوانات در گروه IN در 14 dpi رخ داد.نسبت S/P در هر دو گروه به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل بود (p < 0.05).در 56 dpi بازتاب داده شده استگروه کنترل در طول آزمایش سرونگاتیو باقی ماند (S/P < 0.4).

شکل ۷. آزمایش آنتی بادی خنثی کننده نشان داد که در گروه IN، فقط یک تیتری کم 2 log2 در 28 dpi شناسایی شد که سپس به تدریج به 3.71 log2 در 56 dpi افزایش یافت (شکل 7B).مقادیر آنتی بادی در افراد در یک زمان متفاوت بود.، و ظاهر آنتی بادی های خنثی کننده با پاکسازی ویروس عفونی از سرم پس از 28 دی پی آی (شکل 4B) همزمان بود..

8- تشخیص و عزل PRRSV-1 Lleida 029_22 در هوموجنت های بافتی

RT-qPCR برای اندازه گیری بار ویروسی در بافت های مختلف مورد استفاده قرار گرفت (شکل 4F). در گروه IM، بار ویروسی نسبتاً در تمام بافت ها سازگار بود، با بالاترین بار در ریه ها،گره های لنفاوی میدانیدر گروه IN، بار ویروسی به طور قابل توجهی در بافت ها متفاوت بود، با بالاترین بار در لوزه ها و گره های لنفاوی میدیاستینال.کل بار ویروسی در گروه IN کمتر از گروه IM بود، که ممکن است به زمان مختلف کالبد شکافی مرتبط باشد.تغییرات قابل توجهی در بار بافت در حیوانات آلوده در گروه IN نیز با زمان های مختلف مرگ مرتبط بود (نمونه های خاکستری در 12 ماهگی)، 21 و 43 dpi در مقابل 63 dpi) هیچ RNA ویروسی در هیچ نمونه بافتی از گروه کنترل شناسایی نشد.

جدول ۱. بافت های جمع آوری شده از حیوانات که در ۱۲، ۲۱ یا ۴۳ روز پس از عفونت جان خود را از دست داده اند، برای aVI مثبت بوده است.

(یادداشت جدول: جدول 1 نتایج RT-qPCR و جداسازی ویروس از نمونه های بافت را خلاصه می کند. "MLN" گره های لنفاوی میدیاستینال و "ILN" گره های لنفاوی انگوینال را نشان می دهد.)

9تجزیه و تحلیل پاتولوژیکی و ایمونو هیستوشیمیک بافت های آلوده به PRRSV

یافته های کالبد شکافی: حیوانات که پس از عفونت PRRSV مرده اند (به ویژه آنهایی که بین 12 تا 21 روز پس از عفونت مرده اند) ضایعات سیستماتیک قابل توجهی از جمله پوست بنفش را نشان می دهند.ورم کلی، لنفادونوپاتی شدید، اسپلنومگالی (گاهی اوقات با هیپرپلازی فولیکولی) و خونریزی معده.و لکه های قهوه ای قرمز، سازگار با ذات الریه بینال، با ضایعات شدیدتر در حیوانات که زود از دنیا رفتند (شکل 8A).پریکاردیتدر حیوانات کنترل هیچ ضایعه ی بزرگی مشاهده نشد.

شکل ۸. تجزیه و تحلیل هیستوپاتولوژیک نشان داد که نمرات پنومونی بینشی در حیوانات که در گروه های IM و IN زود از دنیا رفتند (۱۲ تا ۲۱ دی پی آی) بین ۱.۸۳ تا ۳.۳۳ امتیاز بود.این نمرات به طور قابل توجهی در حیوانات قربانی شده در ۶۳ دی پی آی (گروه کنترل) کاهش یافت.در گروه IN، نمره هیستولوژیک لوزه به طور قابل توجهی بالاتر از گروه کنترل در 63 dpi (p<0.05) بود.اما هیچ تفاوت قابل توجهی در دیگر بافت ها مشاهده نشد (شکل 8C).

(کاپیشن: شکل 8B نمرات هیستوپاتولوژیکی را نشان می دهد و شکل 8C نمرات هیستوپاتولوژیکی گروه های مختلف را در 63 dpi مقایسه می کند)

پاتولوژی میکروسکوپی از ذات الریه بینبخشی (گرده شدن دیواره ی آلبویولار، تکثیر سلولی و نفوذ سلول های التهابی) در ریه های تمام حیوانات آلوده نشان داد.مواد خارج شده و بافت مرده در داخل آلوول وجود داشتبافت لنفاوی (غدد لنفاوی و طحال) نشان دهنده لنفوپنی و نکروز شدید است که همراه با آسیب عروقی (به عنوان مثال، ترومبوز و واسکولیت) است.نفوذ سلول های التهابی پری واسوکلوری، ورم و گلیوز در ماده سفید مغز مشاهده شد (شکل 9A).

تجزیه و تحلیل ایمنی هیستوشیمیک (IHC) آنتی ژن های PRRSV را در ماکروفاژها و گاهی اوقات در پنوموسیت های نوع II از ریه ها، غدد لنفاوی، لوزه ها و طحال حیوانات آلوده شناسایی کرد (شکل 9B).آنتی ژن های ویروسی نیز در سلول های التهابی پیرواسکولار در مغز شناسایی شدند..

شکل ۹. عفونت PRRSV باعث آسیب پاتولوژیک گسترده در ریه ها، بافت های لنفاوی و مغز می شود که عمدتا در درون ماکروفاژ ها قرار دارد و ویژگی های پاتولوژیکی سیستماتیک را نشان می دهد.

بحث

PRRSV برای خطوط سلولی مونوسیت محدود است و به طور سنتی با استفاده از ماکروفاج های آلبویولار (PAMs) و سلول های MARC-145 جدا و پرورش داده شده است.PAM ها به سختی به دست می آیند و تغییرات زیادی از دسته به دسته دارند.در این مطالعه، ما از خط سلولی PAM-KNU که به برخی از سویه های میدان حساس است، به جای PAM ها استفاده کردیم.ما موفق به جدا کردن گونه ی "لیدا" 029_22 شدیم.در حال حاضر هیچ خط سلولی جهانی مناسب برای تمام سویه های PRRSV وجود ندارد.و تلاش های آینده برای شناسایی خطوط سلولی مناسب برای جداسازی سویه های مختلف لازم است..

نتیجه گیری

این مطالعه با موفقیت یک مدل از عفونت داخل بینی با یک سویه بسیار ویروس دار از PRRSV-1 را ایجاد کرد.و ویرومیا) بسیار شبیه به موارد مشاهده شده در شیوع های ساحلی است.یافته های کلیدی این بود که مسیر عفونت به طور قابل توجهی بر نتیجه تأثیر می گذارد: عفونت داخل عضلانی (IM) منجر به مرگ و میر حاد 100٪ می شود.در حالی که عفونت داخل بینی (IN) فقط 30 درصد مرگ و میر داشت.، و خوک های آلوده بالاخره کاملا بهبود یافتند.این تفاوت قابل توجه خطر تزریق تزریق IM در مزارع را برجسته می کند که می تواند شدت اپیدمی را از طریق انتقال بیمارستانی به طور قابل توجهی تشدید کند..