कंपनी की खबर सूअरों में पोर्सिन प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस टाइप 1 अत्यधिक घातक है

पोर्सिन प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम (PRRS) वैश्विक सूअर उद्योग को प्रभावित करने वाली सबसे महत्वपूर्ण संक्रामक बीमारियों में से एक है। पूर्वोत्तर स्पेन में एक अत्यधिक रोगजनक PRRSV-1 स्ट्रेन का हालिया उद्भव (पहली बार 2020 में पता चला) ने रोग नियंत्रण के लिए नई चुनौतियाँ पेश की हैं। हालाँकि ये उग्र स्ट्रेन क्षेत्र में विनाशकारी हैं, लेकिन उनके व्यापक प्रायोगिक लक्षण वर्णन अभी तक पूरी तरह से जांचा जाना बाकी है। इसलिए, इस अध्ययन में नए उभरे, अत्यधिक रोगजनक स्पेनिश PRRSV-1 स्ट्रेन, Lleida 029_22, के आनुवंशिक उद्भव, इन विट्रो प्रतिकृति विशेषताओं और रोगजनकता तंत्र की व्यवस्थित रूप से जांच की गई, संक्रमण के दोहरे मार्गों (इंट्रामस्कुलर और इंट्रानैसल) के माध्यम से।

विली ऑनलाइन लाइब्रेरी में प्रकाशित एक हालिया अध्ययन में अत्यधिक रोगजनक PRRSV-1 स्ट्रेन Lleida 029_22 की सूअरों में आनुवंशिक विशेषताओं और रोगजनकता का विश्लेषण किया गया। फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण से पता चला कि Lleida 029_22 स्ट्रेन PRRSV-1 रोसालिया प्रकोप से जुड़े एक नए क्लैड से संबंधित है और अत्यधिक रोगजनक इतालवी स्ट्रेन PR40 के समरूप है। यह स्ट्रेन इन विट्रो में पोर्सिन एल्वियोलर मैक्रोफेज और PAM-KNU कोशिकाओं में कुशलता से प्रतिकृति बनाता है, लेकिन MARC-145 कोशिकाओं में नहीं।

इसकी रोगजनकता का आकलन करने के लिए, आठ सप्ताह के सूअरों को Lleida 029_22 की 2×10⁵ TCID⁵ की समान खुराक के साथ इंट्रामस्कुलर (IM) और इंट्रानैसल (IN) इंजेक्शन के माध्यम से टीका लगाया गया था। IM टीकाकरण के परिणामस्वरूप 14 दिनों के भीतर 100% मृत्यु दर हुई, जिसके साथ उच्च विरेमिया, उच्च वायरल शेडिंग, भड़काऊ साइटोकिन्स (विशेष रूप से IL-6) का महत्वपूर्ण रूप से बढ़ा हुआ स्तर, और गंभीर फेफड़ों के घाव हुए। इसके विपरीत, IN वैक्सीन से टीका लगाए गए सूअरों में कम मृत्यु दर (30%) और मध्यम नैदानिक ​​लक्षण थे। उत्तरजीवी 63 दिनों के बाद ठीक हो गए, लेकिन लंबे समय तक विरेमिया और शेडिंग, और 28वें दिन से आगे भड़काऊ साइटोकिन्स और बेअसर करने वाले एंटीबॉडी का निम्न स्तर प्रदर्शित किया।

दिलचस्प बात यह है कि IN संक्रमण ने स्पेनिश फार्मों पर अत्यधिक उग्र रोसालिया स्ट्रेन के कारण हुए प्रकोप के नैदानिक ​​लक्षणों को वफादारी से दोहराया, जबकि IM संक्रमण ने नोसोकोमियल संचरण के जोखिम को उजागर किया।

पृष्ठभूमि: पोर्सिन प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस (PRRSV) वैश्विक सूअर उद्योग के लिए एक प्रमुख रोगज़नक़ है। इसकी उच्च परिवर्तनशीलता और विविधता मौजूदा टीकों को असंगत रूप से प्रभावी बनाती है। 2020 में, "रोसालिया" नामक एक अत्यधिक उग्र PRRSV-1 स्ट्रेन स्पेन में उभरा और तेजी से फैला, जिससे गंभीर नुकसान हुआ (उदाहरण के लिए, बढ़ते मौसम के दौरान मृत्यु दर में वृद्धि)। आनुवंशिक विश्लेषण से पता चलता है कि यह संभवतः पुनर्संयोजन के माध्यम से एक अत्यधिक उग्र इतालवी स्ट्रेन, PR40 से उत्पन्न हुआ है। यह स्ट्रेन क्षेत्र में उच्च गर्भपात और मृत्यु दर (>20%) का कारण बनता है, लेकिन व्यवस्थित प्रायोगिक डेटा की कमी है।

अध्ययन के उद्देश्य और तरीके: इस अध्ययन का उद्देश्य इन विट्रो और इन विवो प्रयोगों का उपयोग करके रोसालिया प्रकोप से अलग किए गए अत्यधिक उग्र PRRSV-1 स्ट्रेन का व्यापक रूप से वर्णन करना था। आठ सप्ताह के सूअरों को संक्रमण के इंट्रामस्कुलर (IM) और इंट्रानैसल (IN) दोनों मार्गों से टीका लगाया गया था (IM आमतौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला प्रायोगिक मार्ग है, जबकि IN प्राकृतिक संक्रमण का अनुकरण करता है)।

परीक्षण के उद्देश्य: नैदानिक ​​लक्षणों और मृत्यु दर का विस्तृत प्रलेखन; मृत/नेक्रोप्सिड सूअरों की सकल, सूक्ष्म और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल पैथोलॉजिकल जांच; वायरल गतिशीलता और संचरण क्षमता को समझने के लिए सीरम, लार, नाक के स्वाब, मलाशय के स्वाब और ऊतकों में वायरल भार, साथ ही वायरस अलगाव, किया गया था; और PRRSV-विशिष्ट और बेअसर करने वाले एंटीबॉडी के स्तर, साथ ही सीरम साइटोकिन के स्तर का विश्लेषण करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं का आकलन किया गया।

मुख्य महत्व: यह अध्ययन मौजूदा टीकों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने, नए टीके विकसित करने और इस अत्यधिक उग्र स्ट्रेन के रोगजनन को और समझने के लिए एक प्रमुख प्रायोगिक मॉडल और डेटा आधार प्रदान करेगा।

परिणाम

1. PRRSV-1 स्ट्रेन और Nsp2 अमीनो एसिड अनुक्रम लक्षण वर्णन का फ़ाइलोजेनेटिक विश्लेषण

जीनोमिक विशेषताएं और फ़ाइलोजेनेटिक स्थिति:

डीप सीक्वेंसिंग (286×) ने पुष्टि की कि PRRSV-1 Lleida 029_22 स्ट्रेन जीनोम 14,858 nt लंबा है (चित्र 1A), जो फ़ाइलोजेनेटिक रूप से PRRSV-1 सबटाइप 1 वंश से संबंधित है। यह स्ट्रेन तीन अन्य रोसालिया प्रकोप-संबंधित स्ट्रेन से एक स्वतंत्र क्लैड बनाता है (चित्र 1A), 96.61%-97.26% की न्यूक्लियोटाइड पहचान साझा करता है, और अत्यधिक रोगजनक PR40 स्ट्रेन के समरूप है।

Nsp2 विलोपन लक्षण वर्णन:

Lleida 029_22 स्ट्रेन के Nsp2 प्रोटीन में 63-अमीनो एसिड विलोपन (Lelystad स्ट्रेन के सापेक्ष स्थिति 317-379) होता है (चित्र 1B)। यह विलोपन रोसालिया क्लैड के भीतर संरक्षित है, जबकि इसके समरूप स्ट्रेन, PR40 में विलोपन और भी बड़ा है (चित्र 1A), जिससे पता चलता है कि यह आनुवंशिक भिन्नता क्लैड के विकास में जल्दी उत्पन्न हुई।

चित्र 1. PRRSV-1 Lleida 029_22 स्ट्रेन और Nsp2 अनुक्रम संरेखण का फ़ाइलोजेनेटिक पेड़
(A) संपूर्ण जीनोम अनुक्रम (GTR मॉडल, 1000 बूटस्ट्रैप परीक्षण) के आधार पर निर्मित अधिकतम संभावना फ़ाइलोजेनेटिक पेड़।

▲: इस अध्ययन में प्रयुक्त Lleida 029_22 स्ट्रेन; ●: रोसालिया प्रकोप-संबंधित स्ट्रेन।
(B) आंशिक Nsp2 अमीनो एसिड अनुक्रम संरेखण (CLUSTAL जीनोमिक्स वर्कबेंच 24.0.1)।

तुलना किए गए स्ट्रेन: Lleida 029_22, रोसालिया प्रकोप-संबंधित स्ट्रेन, अत्यधिक उग्र PR40 स्ट्रेन, और प्रोटोटाइप Lelystad स्ट्रेन।
*नोट: Nsp2, गैर-संरचनात्मक प्रोटीन 2; PRRSV-1, पोर्सिन प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस टाइप 1।

2. PRRSV-1 Lleida 029_22 स्ट्रेन की इन विट्रो प्रतिकृति विशेषताएं

सबसे पहले, Lleida 029_22 स्ट्रेन की प्रतिकृति विशेषताओं का इन विट्रो में मूल्यांकन किया गया। यह स्ट्रेन PAMs और PAM-KNU कोशिकाओं में कुशलता से प्रतिकृति बनाता है, लेकिन MARC-145 कोशिकाओं में नहीं (चित्र 2A)। तीन प्रकार की कोशिकाओं में वायरल वृद्धि वक्र ने PAMs और PAM-KNU कोशिकाओं में समान वायरल टाइटर्स दिखाए, हालाँकि बाद में थोड़ा कम टाइटर्स थे (चित्र 2B)। 72 घंटों में, दोनों प्रकार की कोशिकाओं ने लगभग 10⁵TCID₅₀/mL के वायरल टाइटर्स तक पहुँच गए। इसके विपरीत, MARC-145 कोशिकाएँ कुशल वायरल संक्रमण को बनाए रखने में असमर्थ थीं, 72 घंटों के बाद वायरल टाइटर्स का पता लगाने योग्य स्तर तक गिर गया।

चित्र 2. तीन सेल लाइनों में PRRSV-1 Lleida 029_22 की वृद्धि कैनेटीक्स
(A) संक्रमण के 72 घंटे बाद फ्लोरोसेंस माइक्रोस्कोपी (MOI = 0.1, एंटी-एन प्रोटीन एंटीबॉडी से धुंधला होना; 20x ऑब्जेक्टिव)
(B) PAM-KNU कोशिकाओं में वायरल टाइटर्स की गतिशीलता (तीन स्वतंत्र प्रयोगों का माध्य ± SD)
*नोट: MOI, संक्रमण की बहुलता; PAM, प्राथमिक एल्वियोलर मैक्रोफेज; PRRSV-1, पोर्सिन प्रजनन और श्वसन सिंड्रोम वायरस टाइप 1।

3. Lleida 029_22 से संक्रमित सूअरों में नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ और मृत्यु दर

PRRSV-1 Lleida 029_22 की रोगजनकता का आकलन इंट्रामस्कुलर (IM) और इंट्रानैसल (IN) टीकाकरण मार्गों से किया गया। IM समूह के सूअरों में 1 dpi से शुरू होकर शरीर का तापमान बढ़ा हुआ दिखा, जो 7 dpi पर 41°C से अधिक हो गया, और 13 dpi तक बना रहा। इंट्रानैसल टीकाकरण समूह में हल्का बुखार था, जो केवल 5 दिनों के बाद टीकाकरण पर 41°C से अधिक हो गया, इसके बाद रुक-रुक कर बुखार का पैटर्न आया। नियंत्रण समूह ने पूरे प्रयोग में कोई असामान्य शरीर का तापमान नहीं दिखाया (चित्र 3A)।

नैदानिक ​​अवलोकनों से पता चला कि IM-संक्रमित समूह में तीव्र श्वसन संकट, तंत्रिका संबंधी लक्षण, गंभीर डिस्पेनिया और कान और अंडकोष का सायनोसिस हुआ, जबकि IN-संक्रमित समूह में मुख्य रूप से मध्यम, लगातार डिस्पेनिया था। अतिरिक्त नैदानिक ​​लक्षणों में फटे हुए फर, एडिमा (अंगों और गर्दन पर सबसे अधिक स्पष्ट), जोड़ों की सूजन, और दोनों समूहों में शरीर की स्थिति में समग्र गिरावट शामिल थी, लेकिन ये IM समूह में अधिक गंभीर थे। ये गंभीर नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ मुख्य रूप से टीकाकरण के बाद 12 और 14 दिनों के बीच केंद्रित थीं, जो उच्च मृत्यु दर या कल्याण कारणों से इच्छामृत्यु की अवधि के साथ मेल खाती थीं।

कुल मिलाकर, IM-संक्रमित समूह में नैदानिक ​​स्कोर टीकाकरण के बाद 11, 12 और 14 दिनों में IN-संक्रमित समूह की तुलना में काफी अधिक थे (p < 0.05), टीकाकरण के बाद 14 दिनों में चरम पर थे (चित्र 3B)। IN समूह में नैदानिक ​​स्कोर कम थे, जो संक्रमण के बाद 13 दिनों में अपने चरम पर पहुँच गए (dpi)। इसके बाद लक्षण धीरे-धीरे कम हो गए, लेकिन स्कोर नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक रहे (p < 0.05)। पूरे प्रयोग में नियंत्रण समूह में कोई नैदानिक ​​लक्षण नहीं देखे गए (चित्र 3B)।

रैखिक मिश्रित मॉडल विश्लेषण (विभिन्न समय बिंदुओं पर एक ही जानवर से टिप्पणियों की गैर-स्वतंत्रता के लिए लेखांकन) से पता चला कि समूह- और दिन-विशिष्ट चर ने पहले 14 दिनों के दौरान शरीर के तापमान और नैदानिक ​​स्कोर को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित किया (p < 0.05)। IM और IN समूहों के बीच, साथ ही दोनों संक्रमण समूहों और नियंत्रण समूह के बीच महत्वपूर्ण अंतर पाए गए।

उत्तरजीविता विश्लेषण से पता चला कि IM संक्रमण समूह के सभी जानवर संक्रमण के बाद 14 दिनों से पहले मर गए, जिसमें 100% मृत्यु दर थी। प्राकृतिक या प्रेरित मौतें संक्रमण के बाद 12 और 14 दिनों के बीच केंद्रित थीं। IN संक्रमण समूह में, संक्रमण के बाद 63 दिनों में मृत्यु दर 30% थी, जिसमें संक्रमण के बाद 12, 21 और 43 दिनों में मौतें हुईं। नियंत्रण समूह के सभी जानवर प्रयोग के अंत तक जीवित रहे (चित्र 3C)।

चित्र 3. PRRSV-1 Lleida 029_22 से संक्रमित सूअरों में नैदानिक ​​परिणाम
(A) संक्रमण के बाद दैनिक मलाशय का तापमान (लाल बिंदीदार रेखा: बुखार सीमा >41°C; माध्य ± SD)
(B) दैनिक माध्य नैदानिक ​​स्कोर (माध्य ± SD; समान अक्षर समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दर्शाते हैं, p < 0.05)
(C) प्रायोगिक समूहों के लिए उत्तरजीविता वक्र
नोट: C, नियंत्रण समूह; IM, इंट्रामस्कुलर समूह; IN, इंट्रानैसल समूह।

4. PRRSV-संक्रमित जानवरों में विरेमिया और वायरल शेडिंग

PRRSV-1 Lleida 029_22 संक्रमण के बाद विरेमिया के स्तर का आकलन RT-qPCR द्वारा किया गया। PRRSV RNA संक्रमण के बाद 3 दिनों में सभी संक्रमित जानवरों के सीरम में पाया गया, IM और IN समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर के साथ नियंत्रण समूह की तुलना में, जो नकारात्मक रहा (p < 0.05; चित्र 4A)। IN समूह में विरेमिया संक्रमण के बाद 7 दिनों में चरम पर था, जबकि IM समूह में वायरल भार संक्रमण के बाद 7 और 14 दिनों दोनों में IN और नियंत्रण समूहों की तुलना में काफी अधिक था (p < 0.05)। इसके बाद, IN समूह में वायरल भार धीरे-धीरे कम हो गया, लेकिन 28 dpi पर अभी भी नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक था।

चित्र 4. लार और नाक/मलाशय के स्वाब द्वारा वायरल शेडिंग का आकलन किया गया। सभी संक्रमित जानवरों का परीक्षण 3 dpi पर लार, नाक और मलाशय के स्वाब में वायरस के लिए सकारात्मक पाया गया।

लार शेडिंग IM समूह में 14 dpi तक और IN समूह में प्रयोग के अंत तक जारी रही (3 dpi पर चरम; चित्र 4B)।

नाक शेडिंग दोनों समूहों में 7 dpi पर चरम पर थी, IM समूह में 7/14 dpi पर IN समूह की तुलना में काफी अधिक वायरल भार के साथ (*p<0.05; चित्र 4C)।

मलाशय शेडिंग IM समूह में 14 dpi तक और IN समूह में 35 dpi तक जारी रही (56 dpi पर थोड़ा उछाल के साथ), दोनों 7 dpi पर चरम पर थे (चित्र 4D)।

AUC विश्लेषण ने पुष्टि की कि संक्रमित समूहों के सभी नमूनों में वायरल भार नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक थे, और IM समूह में नाक स्वाब भार IN समूह की तुलना में अधिक थे (*p<0.05)। संक्षेप में, PRRSV शेडिंग संक्रमण के बाद जल्दी होती है और बनी रहती है।

5. RT-qPCR-पॉजिटिव नमूनों से संक्रामक PRRSV के अलगाव का सत्यापन

RT-qPCR-पॉजिटिव नमूनों में संक्रामक वायरस की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, PAM-KNU कोशिकाओं का उपयोग करके वायरस अलगाव (VI) प्रयोग किए गए (चित्र 5)। सीरम नमूनों के लिए, IM समूह में संक्रमण के बाद 3 और 14 दिनों के बीच एकत्र किए गए नमूनों के लिए वायरस अलगाव की सफलता दर 100% (10/10) थी और IN समूह में संक्रमण के बाद 3 और 7 दिनों के बीच एकत्र किए गए नमूनों के लिए 100% (10/10) थी। हालाँकि, संक्रमण के बाद 14 दिनों में सफलता दर धीरे-धीरे कम हो गई (70%), संक्रमण के बाद 21 दिनों में (55.6%), और संक्रमण के बाद 28 दिनों में (12.5%)।

चित्र 5. तीन संक्रामक वायरस स्ट्रेन को दोनों संक्रमित जानवरों से लार के नमूनों से सफलतापूर्वक अलग किया गया, जो संक्रमण के बाद 3 दिनों में (dpi) दो कल्चर के बाद एकत्र किए गए थे। नाक या मलाशय के स्वाब से कोई संक्रामक वायरस अलग नहीं किया गया।

6. PRRSV-1 Lleida 029_22 संक्रमण से प्रेरित साइटोकिन प्रतिक्रियाएँ

साइटोकिन के स्तर का आकलन करने के लिए संक्रमण के बाद पहले 14 दिनों के दौरान सीरम के नमूने एकत्र किए गए, जिससे तीन समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता चला (चित्र 6)। IFN-α के स्तर संक्रमण के बाद 3, 7 और 14 दिनों में दोनों संक्रमण समूहों में महत्वपूर्ण रूप से बढ़े हुए थे (dpi), IM समूह में IFN-α के स्तर संक्रमण के बाद 14 दिनों में IN समूह की तुलना में काफी अधिक थे (p<0.05)। भड़काऊ साइटोकिन्स IL-1α, IL-12, और IL-6 ने समान रुझान दिखाए: IL-1α संक्रमण के बाद 3 दिनों में IN समूह में बढ़ा और स्थिर रहा, जबकि IM समूह में IL-6 के स्तर संक्रमण के बाद 7 और 14 दिनों में नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक थे (चित्र 6B, D-E)। विशेष रूप से, IL-6 के स्तर संक्रमण के बाद 14 दिनों में IM समूह में IN समूह की तुलना में काफी अधिक थे (p<0.05)। संक्रमित जानवरों के दोनों समूहों में IL-1β ने एक बढ़ती हुई प्रवृत्ति दिखाई, IM समूह में संक्रमण के बाद 3, 7 और 14 दिनों में नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक स्तर दिखा, जबकि IN समूह ने केवल 14 dpi पर एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया (चित्र 6C)।

चित्र 6. IL-12 के स्तर संक्रमण के बाद 14 दिनों में IM समूह में IN समूह और नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक थे (चित्र 6F)। समग्र प्रवृत्ति ने IM समूह में एक मजबूत भड़काऊ साइटोकिन प्रतिक्रिया दिखाई, विशेष रूप से संक्रमण के बाद 7 और 14 दिनों में IL-6 के स्तर में, जो IM समूह में 100% मृत्यु दर के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध था।

7. PRRSV-1 Lleida 029_22 से संक्रमित जानवरों में विशिष्ट और बेअसर करने वाली एंटीबॉडी प्रतिक्रियाएँ

PRRSV-1 और PRRSV-2-विशिष्ट एंटीबॉडी का आकलन वाणिज्यिक ELISA किट का उपयोग करके किया गया (चित्र 7A)। IM समूह में 70% जानवरों में और IN समूह में 90% जानवरों में 14 dpi पर सेरोकोनवर्जन हुआ। दोनों समूहों में S/P अनुपात नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक था (p < 0.05)। IN समूह में एंटीबॉडी का स्तर 21 dpi पर घटने लगा, 42 dpi पर स्थिर रहा, 56 dpi पर उछला, और फिर 63 dpi पर थोड़ा घट गया। नियंत्रण समूह पूरे प्रयोग में सेरोनेगेटिव रहा (S/P < 0.4)।

चित्र 7. बेअसर करने वाले एंटीबॉडी परीक्षण से पता चला कि IN समूह में, 28 dpi पर केवल 2 log₂ का निम्न टाइटर पाया गया, जो फिर 56 dpi पर धीरे-धीरे बढ़कर 3.71 log₂ हो गया (चित्र 7B)। एंटीबॉडी टाइटर्स एक ही समय बिंदु पर व्यक्तियों के बीच भिन्न होते हैं, और बेअसर करने वाली एंटीबॉडी की उपस्थिति 28 dpi के बाद सीरम से संक्रामक वायरस के उन्मूलन के साथ मेल खाती है (चित्र 4B)। नियंत्रण समूह में कोई बेअसर करने वाली एंटीबॉडी का पता नहीं चला।

8. ऊतक होमोजेनेट में PRRSV-1 Lleida 029_22 का पता लगाना और अलगाव

विभिन्न ऊतकों में वायरल भार को मापने के लिए RT-qPCR का उपयोग किया गया (चित्र 4F)। IM समूह में, वायरल भार ऊतकों में अपेक्षाकृत सुसंगत थे, फेफड़ों, मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स और प्लीहा में सबसे अधिक भार के साथ। IN समूह में, वायरल भार ऊतकों में काफी भिन्न थे, टॉन्सिल और मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स में सबसे अधिक भार के साथ। जैसा कि अपेक्षित था, IN समूह में समग्र वायरल भार IM समूह की तुलना में कम था, जो नेक्रोप्सि के विभिन्न समय से संबंधित हो सकता है। IN समूह में संक्रमित जानवरों में ऊतक भार में महत्वपूर्ण परिवर्तनशीलता भी मृत्यु के विभिन्न समय से जुड़ी थी (12, 21 और 43 dpi बनाम 63 dpi पर धूसर नमूने)। नियंत्रण समूह के किसी भी ऊतक के नमूने में कोई वायरल RNA का पता नहीं चला।

तालिका 1. संक्रमण के बाद 12, 21 या 43 दिनों में मरने वाले जानवरों से एकत्र किए गए ऊतक aVI के लिए सकारात्मक परीक्षण किया गया।

(तालिका नोट: तालिका 1 ऊतक नमूनों से RT-qPCR और वायरस अलगाव के परिणामों का सारांश देती है। "MLN" मीडियास्टिनल लिम्फ नोड्स को दर्शाता है, और "ILN" इंगुइनल लिम्फ नोड्स को दर्शाता है।)

9. PRRSV-संक्रमित ऊतकों का पैथोलॉजिकल और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण

नेक्रोप्सि निष्कर्ष: PRRSV संक्रमण के बाद मरने वाले जानवर (विशेष रूप से वे जो संक्रमण के बाद 12 और 21 दिनों के बीच मर गए) ने महत्वपूर्ण प्रणालीगत घाव दिखाए, जिसमें पुरपुरिक त्वचा, सामान्यीकृत एडिमा, गंभीर लिम्फैडेनोपैथी, स्प्लेनोमेगाली (कभी-कभी कूपिक हाइपरप्लासिया के साथ), और गैस्ट्रिक रक्तस्राव शामिल हैं। फुफ्फुसीय घाव प्रमुख थे, आंशिक पतन, बहुफोकल समेकन, और लाल-भूरे रंग के मैक्यूल का प्रदर्शन करते हैं, जो इंटरस्टिशियल निमोनिया के अनुरूप हैं, उन जानवरों में अधिक गंभीर घावों के साथ जो जल्दी मर गए (चित्र 8A)। इंट्रानैसल संक्रमण वाले लगभग 20% जानवरों में माध्यमिक जीवाणु संक्रमण के कारण फोड़े, पेरिकार्डिटिस और गठिया भी विकसित हुए। नियंत्रण जानवरों में कोई सकल घाव नहीं देखा गया।

चित्र 8. हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण से पता चला कि IM और IN समूहों में जल्दी मरने वाले जानवरों (12-21 dpi) में इंटरस्टिशियल निमोनिया स्कोर 1.83 से 3.33 अंक तक था। हालाँकि, ये स्कोर 63 dpi पर बलिदान किए गए जानवरों में काफी कम हो गए (नियंत्रण समूह, 0.17-0.83 अंक; IN समूह, 0.50-1.17 अंक)। विशेष रूप से, IN समूह में टॉन्सिल हिस्टोलॉजिकल स्कोर 63 dpi पर नियंत्रण समूह की तुलना में काफी अधिक था (p<0.05), लेकिन अन्य ऊतकों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया (चित्र 8C)।

(कैप्शन: चित्र 8B हिस्टोपैथोलॉजिकल स्कोर दिखाता है, और चित्र 8C 63 dpi पर विभिन्न समूहों के हिस्टोलॉजिकल स्कोर की तुलना करता है)

माइक्रोस्कोपिक पैथोलॉजी ने सभी संक्रमित जानवरों के फेफड़ों में इंटरस्टिशियल निमोनिया (एल्वियोलर दीवार का मोटा होना, सेलुलर प्रसार, और भड़काऊ कोशिका घुसपैठ) का खुलासा किया। एक्सयूडेट्स और नेक्रोटिक ऊतक एल्वियोली के भीतर मौजूद थे, साथ ही संवहनी क्षति के संकेत भी थे। लिम्फोइड ऊतक (लिम्फ नोड्स और प्लीहा) ने गंभीर लिम्फोपेनिया और नेक्रोसिस दिखाया, जिसके साथ संवहनी क्षति (उदाहरण के लिए, थ्रोम्बोसिस और वास्कुलिटिस) थी। पेरिवास्कुलर भड़काऊ कोशिका घुसपैठ, एडिमा और ग्लियोसिस मस्तिष्क के सफेद पदार्थ में देखे गए (चित्र 9A)।

इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (IHC) विश्लेषण ने संक्रमित जानवरों के फेफड़ों, लिम्फ नोड्स, टॉन्सिल और प्लीहा से मैक्रोफेज में और कभी-कभी टाइप II न्यूमोसाइट्स में PRRSV एंटीजन का पता लगाया (चित्र 9B)। वायरल एंटीजन मस्तिष्क में पेरिवास्कुलर भड़काऊ कोशिकाओं में भी पाए गए।

चित्र 9. PRRSV संक्रमण फेफड़ों, लिम्फोइड ऊतकों और मस्तिष्क में व्यापक पैथोलॉजिकल क्षति का कारण बनता है, जो मुख्य रूप से मैक्रोफेज के भीतर स्थानीयकृत होता है, जो प्रणालीगत पैथोलॉजिकल विशेषताएं प्रदर्शित करता है।

चर्चा

PRRSV में मोनोसाइटिक सेल लाइनों के लिए एक प्रतिबंधित ट्रोपिज्म है और पारंपरिक रूप से एल्वियोलर मैक्रोफेज (PAMs) और MARC-145 कोशिकाओं का उपयोग करके अलग और कल्चर किया गया है। हालाँकि, PAMs प्राप्त करना मुश्किल है और इसमें बड़े बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता होती है, और अत्यधिक रोगजनक स्ट्रेन को MARC-145 के अनुकूल बनाना मुश्किल है। इस अध्ययन में, हमने PAMs के बजाय, अमर सेल लाइन PAM-KNU का उपयोग किया, जो कुछ फील्ड स्ट्रेन के प्रति संवेदनशील है। हमने Lleida 029_22 स्ट्रेन को सफलतापूर्वक अलग किया, जिसका वृद्धि वक्र PAMs में देखे गए के समान था। वर्तमान में, सभी PRRSV स्ट्रेन के लिए कोई सार्वभौमिक सेल लाइन उपयुक्त नहीं है, और विविध स्ट्रेन के अलगाव के लिए अधिक उपयुक्त सेल लाइनों की पहचान करने के लिए भविष्य के प्रयासों की आवश्यकता है।

निष्कर्ष

इस अध्ययन ने अत्यधिक उग्र PRRSV-1 स्ट्रेन के साथ इंट्रानैसल संक्रमण का एक मॉडल सफलतापूर्वक स्थापित किया। नैदानिक ​​अभिव्यक्तियाँ (उच्च मृत्यु दर, गंभीर लक्षण, लगातार उच्च बुखार, और विरेमिया) क्षेत्र के प्रकोप में देखे गए लोगों के समान हैं। मुख्य खोज यह थी कि संक्रमण के मार्ग ने परिणाम को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित किया: इंट्रामस्कुलर (IM) संक्रमण के परिणामस्वरूप 100% तीव्र मृत्यु दर हुई, जबकि इंट्रानैसल (IN) संक्रमण में केवल 30% की मृत्यु दर थी, और संक्रमित सूअर अंततः पूरी तरह से ठीक हो गए। यह महत्वपूर्ण अंतर इस जोखिम को उजागर करता है कि खेत में IM इंजेक्शन प्रथाएं नोसोकोमियल संचरण के माध्यम से महामारी की गंभीरता को महत्वपूर्ण रूप से बढ़ा सकती हैं।